辣椒素抑制缺氧复氧导致的大鼠肺泡ⅱ型上皮细胞凋亡-capsaicin inhibits hypoxia-reoxygenation-induced apoptosis of alveolar type ⅱ epithelial cells in rats.docxVIP

辣椒素抑制缺氧/复氧导致的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中文摘要目的：本实验研究辣椒素对离体缺氧/复氧大鼠肺泡Ⅱ型细胞（ATⅡ）凋亡的影响，以探讨细胞凋亡的可能通路。方法：细胞悬液以0.7~0.8×10^5个/ml密度接种于6孔板内，用含有10%胎牛血清(FBS)的培养基(DMEM)在37℃5%CO2的培养箱中培养ATⅡ，透射电子显微镜和免疫细胞化学（SABC-DAB）的方法进行鉴定；将上述培养并鉴定成功的细胞株分为六组：正常对照组（C组）、单纯缺氧/复氧组（HR组）、缺氧前1h加辣椒素组（CapB组）、缺氧开始时加辣椒素组（CapH组）、复氧开始时加辣椒素组（CapR组）、辣椒平组（CapZ组），除CapZ组n=3外，其余各组n=10。C组为正常培养的细胞，未经任何处理；HR组在37℃1%O294%N25%CO2缺氧环境中用无糖Hank’s缓冲液缺氧24h，不含FBS的DMEM于37℃5%CO2正常条件下复氧24h；CapB组为在缺氧前1h加入50uM辣椒素，待作用1h后换成缺氧用无糖Hank’s缓冲液培养，余处理同HR组；CapH组为在缺氧开始时加入50uM辣椒素，使其在缺氧过程中起作用，余处理同HR组；CapR组为缺氧24h换液后，在复氧开始时加入50uM辣椒素，并继续在复氧条件下培养24h；CapZ组为缺氧前1.5h加入10uM辣椒平预处理，余处理同CapH组。各组均在缺氧/复氧培养24h后用倒置显微镜进行细胞形态学观察、流式细胞仪技术检测细胞凋亡。采用荧光定量PCR（Q-PCR）检测C组细胞生长达培养瓶70%-80%，HR组、CapH组缺氧24h复氧24h后caspase-9的基因表达(n=6)，探讨ATⅡ凋亡的可能通路。结果：（1）ATⅡ胞浆内含有特征性的板层小体，能特异性地表达SP-A、SP-C；（2）①缺氧/复氧可引起ATⅡ细胞凋亡，并且发生形态学改变。倒置显微镜下见C组细胞贴壁连接成片，细胞膜、细胞核完整，上清液干净；HR组、CapB组、CapH组、CapR组、CapZ组经过缺氧24h复氧24h后，贴壁细胞数量明显减少，细胞变圆或长出分支，有些细胞呈颗粒状，细胞膜完整、但胞核脆裂，上清液中见呈白色颗粒状脱落的细胞；②与HR组比较，CapH组贴壁细胞相对较多，脱落的细胞减少；而CapB组、CapR组、CapZ组与HR组比较，无明显变2化；③经过辣椒平处理后，CapZ组脱落的细胞较CapH组增多，贴壁细胞减少。（3）流式细胞仪检测结果示：①与C组比较，HR组、CapB组、CapH组、CapR组、CapZ组细胞凋亡率明显升高（p＜0.05）；②与HR组比较，CapH组细胞凋亡率明显降低（p＜0.05）；CapB组、CapR组、CapZ组ATⅡ细胞凋亡率无明显变化（p＞0.05）；③与CapB组、CapR组比较，CapH组细胞凋亡率明显减少（p0.05）；④与CapH组比较，CapZ组ATⅡ凋亡百分率明显上升（p＜0.05）。（4）与C组比较，HR组caspase-9mRNA含量约增高3倍，在CapH组稍增加；与HR组比较，CapH组caspase-9mRNA含量约降低2倍。结论：（1）辣椒素能够减少缺氧/复氧大鼠ATⅡ凋亡，特别是在开始缺氧时加辣椒素对缺氧/复氧大鼠ATⅡ起着保护作用；（2）辣椒素可能通过作用于TRPV1受体对缺氧/复氧大鼠ATⅡ起保护作用；（3）缺氧/复氧引起ATⅡ的凋亡可能与内源性途径激活caspase-9有关，辣椒素可能通过减少caspase-9的基因表达来减少缺氧/复氧细胞的凋亡。关键词ATⅡ；缺氧/复氧；辣椒素；细胞凋亡3CapsaicinInhibitstheApoptosisofRatAlveolarEpithelialTypeⅡCellsUndergoingHypoxia/ReoxygenationABSTRACTPurpose:OurexperimentaimedtoexplorewhethercapsaicinwouldaffectratalveolarepithelialtypeⅡcells(ATⅡ)apoptosisaftertheyunderwenthypoxia/reoxygenation(HR)andthepossiblepathwaysofcelldeathinvitro.Method:ATⅡwereinoculatedatthedensityof0.7~0.8×10^5/mlinsixwellplate,culturedwithDulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM)supplementedwith10%fetalbovineserum(FBS)inanatmosphereof37℃5%CO2incubator,andidentified