利用dna家族改组技术创制植物强耐盐nah逆向转运蛋白基因-using dna family reorganization technology to create plant salt-tolerant nah reverse transporter gene.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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利用dna家族改组技术创制植物强耐盐nah逆向转运蛋白基因-using dna family reorganization technology to create plant salt-tolerant nah reverse transporter gene.docx

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利用dna家族改组技术创制植物强耐盐nah逆向转运蛋白基因-using dna family reorganization technology to create plant salt-tolerant nah reverse transporter gene

中文摘要土壤盐渍化是影响植物生长发育和农作物产量的重要非生物胁迫因素。为了避免Na+对细胞的毒害作用，植物特别是盐生植物抵御盐胁迫的有效策略之一就是通过液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白将细胞质中过多的Na+区域化到液泡中。同时，Na+又可作为一种有益的渗透调节剂来降低细胞的渗透势，从而使植物能更好的适应盐渍环境。在不同植物中过量表达液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因均可显著提高转基因植物的耐盐性，说明液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白是一种重要的耐盐决定因子。然而，目前已克隆的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白存在转运活性相对较低，耐盐性不高的问题。因此，对已有比较耐盐的Na+/H+逆向转运蛋白基因进行改造，然后将此耐盐基因转入到作物中，进而培育耐盐新品种对于农业生产具有重大实践意义。DNA家族改组（DNAfamilyShuffling）技术是一种应用于酶、蛋白质和单克隆抗体等体外定向进化的快速高效的分子生物学方法，该技术在提高酶活性和稳定性以及改变底物特异性等方面具有广泛的应用前景。本研究以盐生植物碱蓬和盐角草的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因（SsNHX1和SeNHX1）为模板，利用DNAfamilyshuffling技术进行定向进化，并结合酵母突变体表达系统进行筛选，成功获得了一个新的耐盐性显著增强的改组基因，命名为SseNHX1。序列比较分析发现，SseNHX1较亲本SsNHX1有14个氨基酸的突变，其中有12个突变的氨基酸来自于另一亲本SeNHX1序列。酵母功能互补试验显示，SseNHX1表达的Na+/H+逆向转运蛋白较SsNHX1和SeNHX1基因的表达产物耐NaCl能力分别提高了1.4和1.2倍。与亲本基因比较，表达SseNHX1的酵母转化子液泡中富集更多的Na+，表明其耐盐性的增强是通过离子转运来实现的。此外，转SseNHX1基因的酵母转化子也提高了对LiCl的耐受性，而对KCl和潮霉素的耐受性与两个亲本基因基本类似，表明突变位点的出现并没有导致该蛋白活性对其他阳离子耐受性的变化。将GFP基因融合到SseNHX1的C末端，在洋葱表皮细胞中瞬时表达。激光共聚焦结果显示，SseNHX1表达的蛋白主要定位于液泡膜上。为了验证改组基因SseNHX1对植物耐盐性的影响，通过农杆菌介导的叶盘转化法，将SseNHX1和SsNHX1、SeNHX1基因分别转入烟草中。半定量PCR分析表明不同的Na+/H+逆向转运蛋白基因在转基因烟草中均可正常表达。在对SseNHX1基因的耐盐性评价试验中发现，在200mM和300mMNaCl条件下，过量表达SseNHX1和亲本基因的烟草幼苗生长状况明显优于转有空载体的烟草幼苗，而且转有SseNHX1基因烟草的叶绿素含量、根长、鲜重、干重都高于转有亲本基因的烟草。在对盆栽烟草苗进行400mMNaCl处理时发现，过量表达SseNHX1的烟草在光合速率、脯氨酸含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）等生理指标上都高于过量表达亲本基因和空载体的烟草，且其地上部分Na+和K+含量也都高于转有亲本基因和空载体的烟草。关键词：DNA家族改组；Na+/H+逆向转运蛋白；酵母；耐盐性；烟草ABSTRACTSoilsalinityisamajorabioticstressfactorthatimpactsplantgrowthandproductivity.Toavoidthetoxiceffectsofsalt,plantsespeciallyhalophyteshavedevelopedamechanismtosequesterNa+intovacuolesthroughNa+/H+antiporters.ThecompartmentationofNa+invacuolesavertsthedeleteriouseffectsofNa+inthecytosol,whilemediatingvacuolarosmoticadjustmentthatfacilitateswateruptakeintocells,therebyfacilitatingtheimprovementofplantsadaptationandtolerancetosalinity.ThevacuolarNa+/H+antiporterisanimportantdeterminantincontrollingplantsalttoleranceasevidencedbytheenhancedtolerancetosaltstressinvariousplantspeciesoverexpressingNa+/H+antiporters.However,theidentifiedNa+/H+antiportershavetheproblems