利用selex技术筛选高危型hpv l1蛋白适体的研究与探讨-study and discussion on screening high-risk hpv l1 protein aptamers by selex technology.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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利用selex技术筛选高危型hpv l1蛋白适体的研究与探讨-study and discussion on screening high-risk hpv l1 protein aptamers by selex technology.docx

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华华中科技大学硕士学位论文 PAGE 52 PAGE 52 英文缩略词表缩略词英文全称中文全称 HPV human papillomavirus 人类乳头瘤病毒 HR-HPV high-risk human papillomavirus 高危型人乳头瘤病毒 BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白 CIN cervical intraepithelial neoplasia 宫颈上皮内瘤样病变 DM-270C dynabeads M-270 carboxylic acid 羧基标记磁珠 DM-280S dynabeads M-280 streptavidin 链霉亲和素标记磁珠 EDC 1-ethyl-(3-dimethyllaminopropyl) carbodiimide hydrochloride 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜 ELASA enzyme-linked aptamer sorbent assay 酶连接适体混合吸附法 EDTA ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸 Amp ampicillin 氨苄青霉素 IgY immunoglobulin of egg yolk 鸡卵黄免疫球蛋白 Kd the dissociation constant 解离常数 KLH keyhole limpet hemocyanin 钥孔血蓝蛋白 LB luria-bertani medium LB培养基 MES 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid 2-(N-吗啉代)乙磺酸 OD optical density 光密度 PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 RPM round per minute 转/分 SA streptavidin 链霉亲合素 SELEX systematic evolution of ligands by exponential enrichment 指数富集配体的系统进化 ssDNA single-stranded DNA 单链DNA dsDNA double stranded DNA 双链DNA 利用 SELEX 技术筛选高危型 HPV L1 蛋白适体的研究与探讨中文摘要目的：人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌发生的必要前提。筛查 HPV 感染是宫颈癌早发现、早预防、早治疗的关键。利用指数富集配体的系统进化 (SELEX)技术，筛选出与高危型 HPV(HR-HPV) L1 蛋白高亲和力、高特异性结合的适体，配合特异性 IgY 建立酶连接适体混合吸附体系（ELASA），用于快速检测 HR-HPV。方法：运用生物信息学分析方法对我国常见 HR-HPV（16、18、58、52 和 31 型）L1 蛋白的 B 细胞抗原表位进行综合分析，建立 HR-HPV 抗原表位肽谱；人工合成抗原表位肽，以此为靶标，利用 SELEX 技术，从体外合成的全长 78nt （其中包含 35nt 的随机序列）的寡核苷酸文库中筛选出能特异性识别 HR-HPV L1 蛋白的 DNA 核酸适体，结合动物免疫获得的特异性 IgY 建立针对 HR-HPV 的 ELASA 体系；用经临床 HC-2 检测确诊的 HR-HPV 感染的宫颈分泌物检验该体系检出 HR-HPV 的特异性和灵敏度。结果：人工合成的 2 个具有诊断潜能的 B 细胞抗原表位肽，其纯度大于 99% 。经过多轮的 SELEX 筛选，得到 18 条适体链序列，序列的相似性为 69.14%，适体的二级结构以发卡、茎环为主。其中与多肽的结合能力最高的是 3、7 和 12 号适体，12 号适体的 Kd 值可低至 53.93 nmol/L。经动物免疫获得的 IgY 效价为 1:12500~1:62500。适体结合 IgY 建立的 ELASA 体系有良好的特异性和灵敏度。结论：本研究利用 SELEX 技术成功筛选到针对我国常见 HR-HPV L1 高亲和力、高特异性的 ssDNA 适体群，结合特异性 IgY 建立用于快速检测 HR-HPV 的 ELASA 体系。关键词：指数富集配体的系统进化技术；HPV L1；适体；酶连接适体混合吸附法 In vitro selection of aptamers to high-risk HPV L1 protein by SELEX Abstract Objective: