利用ssh技术筛选与鉴定小鼠moe内受ac3调控差异表达基因-screening and identification of differentially expressed genes regulated by ac3 in mice moe by ssh technology.docxVIP

摘 摘 要 摘 要 在哺乳动物中，嗅觉功能的行使依赖两个主要功能器官，即主要嗅觉表皮（MOE） 和犁鼻器（VNO），研究表明MOE内嗅觉信号转导过程是由cAMP信号通路介导的。小 鼠MOE内cAMP信号通路的主要成分包括嗅觉受体、Golf蛋白、腺苷酸环化酶3（AC3） 和环核苷酸门控离子通道（CNG）等。AC3基因在小鼠MOE内的嗅觉信号传导中起着重 要作用，AC3基因缺失不仅能引起小鼠嗅觉功能丧失，甚至还会影响到小鼠学习与记忆 能力、生殖能力、体重等方面。但是，AC3基因缺失后，是否会导致MOE内与之相关的 基因发生差异表达，目前还没有任何了解。抑制性消减杂交（SSH）技术是在消减杂交 和抑制性PCR扩增基础上建立起来的筛选差异表达基因的有效方法，其操作简捷、准确 率高、假阳性低，已被广大研究者应用于各个领域。因此，本文利用SSH技术对AC3基 因敲除小鼠MOE内受其调控的差异表达基因进行筛选，以期阐释AC3基因对小鼠嗅觉产 生影响的相关机制。 本文以AC3基因敲除（AC3-/-）及其同窝出生的野生型（AC3+/+）小鼠MOE为材料， 提取其中的RNA，并反转录成双链cDNA，经过消减杂交，构建了正向和反向两个消减 文库。采用dot blot方法对消减文库进行初步筛选，并对筛选出的差异表达基因进行序列 测定及生物信息学分析。利用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对所筛选的差异表达基因 的相对表达量进行分析。 在实验过程中，我们获得了高质量的总 RNA，高效率的接头连接，对比明显的巢 式第二次 PCR 结果，以及获得了差异程度 10-15 个循环的消减杂交效率验证结果。利用 M13F 和 M13R 引物检验文库中阳性克隆，结果显示所挑选的阳性克隆均携带 100bp 以 上的目的片段。Dot blot 筛选得到 386 个差异表达克隆，随机选取其中的 80 个进行 DNA 序列测定，经序列比对后发现有 62 个在 GenBank 上获得与之相匹配的基因信息，其中 24 个上调差异表达克隆对应于 kcnk3、mapk7、megf11 等基因，38 个下调差异表达克隆 对应于 tmem88b、c-mip、skp1a、mlycd 等基因。利用 Gene Ontology（GO）方法对这些 差异表达基因进行蛋白功能注释，并在 WeGo 网上进行统计制图，发现它们主要集中在 分子结合、细胞周期、生物和细胞过程等功能方面。选取其中上调基因 kcnk3 和下调基 因 c-mip、mlycd、tmem88b 及 trappc5 进行 qRT-PCR 实验。结果表明，在 AC3-/-小鼠 I MOE 内 kcnk3 的表达量显著上调，是对照组小鼠的 127%，而 c-mip、mlycd、tmem88b 和 trappc5 的表达量显著下调，分别为对照组小鼠的 20%、7%、32%和 29%。 上述实验结果表明，我们利用 SSH 技术，成功构建了 AC3 基因在 MOE 组织内的 正向与反向消减杂交文库。并对文库进行了 dot blot 筛选和 qRT-PCR 验证。经过 DNA 测序分析及蛋白质功能注释，发现这些差异表达基因与 K+通道、细胞发育与分化、脂 肪代谢和膜蛋白转运等生物学功能密切相关。推测它们可能与 AC3 基因共同作用，影 响到小鼠 MOE 内嗅觉电位的形成、MOE 组织的发育、嗅觉感觉神经元的代谢能力以及 嗅觉受体的合成与分泌等生物学过程，进而影响到小鼠 MOE 内的嗅觉信号转导功能。 关键词 腺苷酸环化酶 3 主要嗅觉表皮 差异表达基因 抑制性消减杂交 II Abstract Abstract PAGE PAGE IV Abstract Among the mammal animals, olfactory is mainly base on these two functional organs，the main olfactory epithelium (MOE) and the vomeronasal organ (VNO). Several studies suggested that olfactory signal was mediated by the cAMP signal pathway in the MOE. Adenylate cyclase 3 (AC3) is one of the major players in the olfactory signaling within the main olfactory epithelium (MOE) of mice, other components are olfactory receptor (OR), Golf protei