利用不同底物生产13丙二醇及基因工程菌的构建-production of 13 propylene glycol by different substrates and construction of genetically engineered bacteria.docxVIP

摘要v1，3-两二醉是一种重要的化工原料，广泛应用于食品、医药等多个领域，其中1，3- 内工醉最竟要的用途是作为合成新型聚酣材料聚对苯二甲酸内二醉酣CPη) 的单体。 但目前只有化学法实现了 1，3-丙二醉工业化生产。与化学法相比，微生物法具有反应条 件温和、对环境条件友好等优点受到广泛重视。迄今为止，自然界中的微生物只能以甘 油为底物发酵生产 1，3-丙工醉，由于原料成本较高，与化学法相比，微生物法制备1，3唰 内二醇仍不具有竞争优势。为此，论文围绕提高生产效率，降低生产成本的研究目 标，分别以 Klebsiella pneumoniae ，模式菌株 Saccharomyces cerevisiae W303-1A 和工业 化甘油生产菌株 Candida glycerinogenes 为研究对象，采用基因工程、代谢工程和发酵工 程等生物技术手段开展了应用微生物法生产 1，3唰两二醉的研究，取得了以下主要研究成 果:1)为降低 κ pneumoniae 产 1，3-内工醇过程中由中间产物 3-经慕内醋。-HPA) 累 积对商体生长和发酵的不利影响，以氯每素乙毗转移酶基因 cat 为报告基因，成功构建 了κ pneumoni 刷新型表达系统 pETP 阳n，并应用该表达系统在 κ pneumoniae 中过最表 达了 1，3-丙工醇氧化还原酶基因 dhaT ，构建了震细菌 κ pneumoniae/pETPkan-dhaT 0 在 发酵过程中，重组菌 3-HPA 的最大积累量与原始菌株相比，降低了约 3 倍，从而有效的 促进了菌体生长、甘油消耗和产物合成，最终 1，3-丙二醉产最为 28.9 g/L 比野生菌提 高了 16.5%。2) 考察了摇瓶水平上初始甘油、氮源、无机盐等培养条件和 pH 、温度、接种最等 发酵工艺条件对重组商 κ pneumoniae/pE 丁Pkan-dhaT 甘油转化率和菌体生长的影响，通过单因素和正交实验设计，优化了发酵培养基组成:甘油 60 g/L，酵母膏 7 g/L，(N hS04 0.3 g/L，拧橡酸 8 g/L;优化了发酵工艺条件:初始 pH7.0 ，培养温度30.C ，装液量50 mL/250mL 三角瓶，发酵接种最 Cv/v) 6%。在优化的培养和工艺条件下，意组菌的1，3-内工醉产最达到 37.7 g/L，甘油质量转化率提高空 62.8%。考察了7 L 发酵罐上搅拌速 度对 1，3翩丙二醉分批发酵实验的影响，在 300 r/min 的条件下， 1，3-丙二醇浓度、甘油转 化率分别最高达 36.4 g/L， 60%0 7 L 发酵罐补料分批发酵实验，发酵 45 h 后测得 1，3幽 丙二醇产量为 62.2 g/Lo3) 利用C. glycerinogenes 生产的不同类型的甘油替代意组酶发酵培养基中的纯甘 泊。首先以C. glycerinogenes 甘油发酵液直接作为原料，发酵结果显示，甘油发酵液中 乙醇、乙酸等物质影响了菌体的生长和甘泊的消耗，发酵 50 h 1，3-丙工醇产最仅为 8.9g/L;在添加 NaCl 维持高渗条件下，已 glycerinogenes 发酵培养基初始葡萄糖浓度的降 低有效减少了乙醉、乙酸的生成，以此发酵液作为重组菌 κ pneumoniae/pET Pkan-dhaT 发酵底物，发酵 40 h 后， 1，3幽两二醇产量为 24.7 g/L;最后选择工业级甘油为底物发酵产 1，3-丙二醉，测得 1，3-闪二醇含量为 33.5 g/L ，甘油质量转化率为55.8% 。以工业级甘 油为原料 ，Kp.neumoniae/pETPkan-dhaT 7 L 发酵罐补料分批发酵， 1，3-内工醇产量达 57.8g/Lo 以上实验结果说明工业级甘油可成为替代纯甘油发酵的廉价原料。的首先克隆了 κ pneumoniae 甘油合成 1，3.内二醉途径中 8.0 kb 左右大小的 dha 操 纵子，并在大肠杆菌几 1109 中进行了有效表达，测得甘油脱水酶 (GDHt) 和 1，3制内二 醇氧化还原酶 CPDOR) 比酶活分别为 1.8 U/mg 和 0.8 U/mg ，携带dha 操纵子的大肠杆 菌在以甘油为底物发酵时，可合成 8.6 g/L 1，3.丙二醇:直接将 8.0 kb dha 操纵子在模式 菌株眼酒酵母 S. cerevisiae W303.1A 中表达，由于 GDHt 和 PDOR 比酶活仅有 0.4 U/mg 和 0.3 U/mg ，最终导致在以葡萄糖为底物的发酵液中未检测到 1，3-两二醇:为增强 dha 基因在 S. cerevisiae W303.1A 中的表达，将 dhaB 和 dhα丁基因分别置于启动子 GAP 和