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脂肪酶活性条件试验设计 脂肪酶的最适温度测定试验 一、目的：测量脂肪酶的最适反应温度 二、原理：脂肪酶能分解脂肪产生脂肪酸，使得反应液ph下降，用0.01mol/LNaOH溶液中和所产生的脂肪酸，所消耗的0.01mol/LNaOH溶液体积与酶的活性成正相关性。不同温度下，酶的活性与温度的关系可以通过0.01mol/LNaOH溶液体积间接反映出来。 三、方法：为保证测量结果的准确，脂肪酶的最适反应温度试验在国标里脂肪酶的活性测定的检验方法基础上改动震荡水浴温度，其余尽量保持不变。 四、检测步骤： 酶活的测定（NaOH滴定法） 固体：精密称取固状酶粉0.500g，放入小烧杯中，用约50ml缓冲液溶解，磁力搅拌15-20分钟，转移至100ml容量瓶中，用缓冲液都次冲洗烧杯，同时转移到容量瓶中，（注意不要起泡），定容至刻度，振摇1分钟左右，静置20分钟以上，取上清液再次进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在4.5-5.5ml范围内。 液体：准确吸取1ml样品于100ml容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照品之差在4.5-5.5ml范围内。再次稀释不得超过两次。 测定：取100ml三角瓶3只，其中2只是试样，1只是空白对照，每杯中的组成液为：4.0ml缓冲液（pH9.4），5.0ml橄榄油乳化液，1.0ml酶液。以上除酶液以外的组成液置于20摄氏度水浴锅预热5分钟，然后精确加入1ml酶液，精确计时，缓慢震荡（80次每分钟），保温10分钟，立即加入95%酒精20ml，取出，加入10ml30%氯化钠溶液，摇匀，使之破乳约1分钟，并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热5分钟，保温10分钟，立即加入20ml95%酒精（1ml酶液先加入该20ml95%酒精灭活）。 用0.01mol/NaOH滴定样品至空白溶液的pH。反应后的样品应在半小时内完成滴定。 通过计算算出酶的活性，记录结果。 将水浴锅分别设定为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70摄氏度，重复以上试验。 五、结果数据： 酶的最适温度（） 温度（单位：摄氏度） 稀释倍数 消耗碱液体积 酶的活性值 备注 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 总结 脂肪酶的最适pH测定试验 一、目的：测定脂肪酶的最适反应pH值 二、原理：在特定的温度和特定的反应时间里，酶的活性与所产生的脂肪酸成正相关性，酶在不同的PH环境下的活性差别与所产生的脂肪酸的含量成正相关性，因此，可以通过酶催化反应前后的酸度变化以及滴定反应液至反应前的ph浓度和通过消耗掉的0.01mol/L的NaOH溶液体积的大小来判断最适的ph值。 三、方法：选择对脂肪酶催化有惰性的缓冲液，利用盐酸或者氢氧化钠滴定至所需的酸度，用此酸度的缓冲溶液替换国标“脂肪酶活性测定”里的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液来与橄榄油-PVA乳化液混合，并再次滴定校正pH至所需酸度。不同PH段选择不同的缓冲液，其中pH=4~5的时候选择0.05mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液（2.2-5.0），pH=6~8的时候选用0.05mol/L磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液（5.8-8.0），pH=8.6~10的时候选择0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(8.6-10.6)，pH=11~12的时候选择0.05mol/L磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液10.9-12.0）。 四、试验过程： 酶水解反应缓冲液配制： 取浓度为0.05mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液0.05mol/L的盐酸分别滴定至pH=4和pH=5，备用。 取浓度为0.05mol/L的磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液0.05mol/L的盐酸或者氢氧化钠分别滴定至pH=6、pH=7和pH=8，备用。 取浓度为0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液0.05mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH=8.6、pH=9、pH=10备用。 取浓度为0.05mol/L磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液0.05mol/L氢氧化钠溶液分别滴定至pH=11、pH=12，备用。 酶活的测定（NaOH滴定法） 固体：精密称取固状酶粉0.500g，放入小烧杯中，用约50ml甘氨酸-氢氧化钠溶液溶解，磁力搅拌15-20分钟，转移至100ml容量瓶中，用缓冲液多次冲洗烧杯，同时转移到容量瓶中，（注意不要起泡），定容至刻度，振摇1分钟左右，静置20分钟以上，取上清液再次进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在4.5-5.5ml范围内。 液体：准确吸取1ml样品于100ml容量瓶中，用缓冲液定溶到刻度，摇匀，进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照品