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过量运动对大鼠心肌细胞钙离子通道影响 　　摘要:研究过量运动对心室肌细胞钙离子通道的影响,旨在进一步探讨其在心肌损伤中的意义。制备离体心室肌细胞并用去甲肾上腺素(NE)诱导建立类似过量运动所产生的应激心肌细胞模型,应用流式细胞术(FCM)和Fura2荧光分光光度法测定应激心室肌细胞的凋亡率和心肌细胞内游离钙浓度变化。FCM检测发现10-4mol/L的NE模拟应激可导致心室肌细胞凋亡率明显上升,对照组:0.41%,应激组:2.57%(P 　　关键词:钙离子通道 过量运动 心肌细胞 细胞凋亡 　　 　　前言 　　应激是指机体在内外界环境的有害因素刺激下,机体所产生的全身非特异性反应,主要表现为交环灌流10～15min,至心脏柔软膨大为止。过量运动可引起机体的应激反应,过度的应激反应可引起机体包括心血管系统在内的多种系统发生病交,导致心肌功能严重受损。然而对于此类疾病的发病机制尚不清楚,尤其对于心肌细胞离子通道在其中所发挥的作用及意义鲜有报道。钙离子参与多种生命活动过程钙通道广泛存在于机体的各种类型组织细胞中,并且在不同的组织细胞,或同一组织细胞不同部位其钙通道的类型及生理功能各不相同。钙离子通道是细胞膜上的一类特殊亲水性蛋白质微孔道,是神经、肌肉细胞电活动的物质基础。随着分子生物学的发展,人们对钙离子通道的分子结构及特性有了更加深入的认识,并发现其功能、结构异常与许多疾病的发生和发展有关。细胞膜上有很多Ca+2通道来调节细胞内的Ca+2的平衡。TRPM8是一种非选择性阳离子通道,属于TRP蛋白的TRPM亚族。其他两个亚族是TRPC和TRPV家族。心肌细胞膜TRPM8钙离子通道对心肌细胞的正常生理功能有重要的意义。本文研究应激对心肌细胞膜TRPM8钙离子通道的影响,旨在进一步探讨其在心肌损伤中的意义。 　　1、材料与方法 　　1.1实验材料 　　Wistar大鼠购自湖北省卫生防疫站。 　　1.2实验方法 　　1.2.1大鼠心室肌细胞的制备 　　取雄性成年200～250g体重Wistar大鼠,断头、开胸,迅速取出心脏,于4℃无钙台氏液中(mmol/L):NaCI 116、KCI 5.4、NaH2PO4 1.4、NaH2 C03 15、MgS04 1、葡萄糖15、HEPES 5,用NaOH调pH值至7.4。小心去除脂肪以及结缔组织,将主动脉用棉线固定于Langendroff灌流装置上,事???预热至37℃的无钙台氏液灌流5min去除淤血后,再用C02的混合气饱和并恒温至37℃。剪下心室部分于KB液(mmol/L:L2谷氨酸70、KCL25、牛黄酸20、KH2 P04 10、MgCl2 3、HEPES 10、葡萄糖10、EG2TA 0.5(KOH调pH至7.4)中剪碎,轻轻吹打,经细尼龙网(孔径105μm)过滤,细胞存活率达80%以上,最后细胞悬液置4℃冰箱保存1h备用。 　　1.2.2大鼠心室肌细胞应激模型的建立 　　去甲肾上腺素(noradrenaline,NAD)主要激动α受体,对β受体激动作用很弱,具有很强的血管收缩作用,使全身小动脉与小静脉都收缩(但冠状血管扩张),外周阻力增高,血压上升。兴奋心脏及抑制平滑肌的作用都比肾上腺素弱。临床上主要利用它的升压作用,静脉滴注用于各种休克(但出血性休克禁用),以提高血压,保证对重要器官(如脑)的血液供应。应激定义为机体在心理、环境或者物理应激原刺激下,激活下丘脑―垂体―肾上腺轴和交感神经系统导致生理的变化或适应。模拟应激状态下机体去甲肾上腺素分泌水平的上升,分别以含10-4、10-5、10-6mo1/L NE的细胞外液(mmol/L):(氯化胆碱120、CsCl4、CaCl2 1.8、MgCl2 2、HEPES 10、Glucose 10,以Tris 调pH至7.4)灌流心室肌细胞10 min,诱导建立应激心肌细胞模型。 　　1.2.3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡 　　流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是:①测量速度快,最快可在1秒种内计测数万个细胞:②可进行多参数测量,可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量,并具有明显的统计学意义;③是一门综合性的高科技方法,它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果;④既是细胞分析技术,又是精确的分选技术。 　　用PBS洗细胞两次,离心收集约5×105细胞,用含5%胎牛血清PBS重悬细胞,加入无水乙醇0.7 m1,混匀,-20℃固定24 h以上。2000×g离心5min,弃上清,用PBS洗两次,加RNase至终浓度50 g/L溶于0.15 mmol/L NaCl、0.1mmol/L