MBP-his融合蛋白纯化及放大.pdfVIP

GE Healthcare 应用手册 28-4044-79AA 亲和层析 使用Ni Sepharose 6 Fast Flow 纯化组氨酸标签的麦 芽糖结合蛋白-方法优化和放大 摘要 该应用讲述如何在纯化麦芽糖结合蛋白过程中对Ni Sepharose™ 6 Fast Flow捕获步骤进行放大。该麦芽 糖结合蛋白MBP-(His)6为大肠杆菌表达的含组氨酸 标签的重组蛋白。Ni Sepharose™ 6 Fast Flow属于固 定化金属亲和层析（IMAC）介质，对组氨酸标签蛋 TM介质家 白具有高的蛋白结合能力。作为BioProcess 族中的一员，Ni Sepharose™ 6 Fast Flow能满足生物 技术工业生产的需要，包括供货的安全性，全面的 规范支持以及所有生产应用所需的支持。 本项研究展示了过程优化和放大工艺的结果。该方 法首先通过HisTrap FF 1ml柱进行实验室规模的优 图1. 使用ÄKTApilot™对组氨酸标签蛋白纯化进行 化，以寻求高样品载量下蛋白纯化的最佳条件。已 放大处理。 知通过优化的咪唑浓度（5mM ）能成功纯化88%的 蛋白结合载量。这些条件被用于HisPrep FF 16/10柱 概述 （20ml ）对MBP-(His)6蛋白的纯化的过程优化。在两 个独立的纯化实验中，每次过柱均有超过500mg的 IMAC已经成为组氨酸标签蛋白亲和纯化中应用最 蛋白质被纯化，并获得高的蛋白质回收率。该方案 广泛的技术之一。镍（Ni2+）因其与组氨酸标签蛋 可通过ÄKTApilot™系统以及预装210 ml的Ni 白的高亲和性而成为最常使用的金属离子。蛋白结 Sepharose™ 6 Fast Flow进行10倍放大。达到这个规 合可被咪唑洗脱所破坏，这一作用主要通过占据金 模后，可一次性上样5500 mg蛋白，并通过纯化获 属螯合位点实现，同样通过降低洗脱缓冲液PH值使 得94%的目标蛋白回收率。 氨基酸侧链发生质子化也可对蛋白结合进行破坏。 该结果表明Ni Sepharose™ 6 Fast Flow极其适合于 带组氨酸标签的目标蛋白的高产率捕获。 Ni Sepharose™ 6 Fast Flow是专为组氨酸标签蛋白 中，将Ni Sepharose™ 6 Fast Flow填入AxiChrom 50 设计的一种层析介质。 柱（内径为50 mm ）后，采用ÄKTApilot™层析系统 在室温下操作。Ni Sepharose™ 6 Fast Flow用去离子 预先螯合Ni2+ ，低离子脱落 水搅匀后载入AxiChrom 50柱，以60 cm/h （19.6 高蛋白结合能力 ml/min）线性流速填充。填充床进一步通过轴向挤 全部PH范围内可保持稳定，与一般组氨酸标签 压压缩15%至床高10.7cm ，柱体积210ml。 蛋白纯化过程中使用的表面活性剂，变性剂以及 还原剂兼容。 从ÄKTAexplorer™系统流出的物质通过Frac-950成 分收集器进行收集，Ä