两种新型选择复制性腺病毒m5m6与复制缺陷型腺病毒advtk的有效性以及安全性的系统比较-systematic comparison of the efficacy and safety of two new selective replication adenoviruses m5m6 and replication-defective adenovirus advtk.docx

中文摘要第一部分新型选择复制性腺病毒M5以及M6的构建及鉴定【目的】构建及鉴定两种表达HSV-TK基因的新型选择复制性腺病毒【方法】采用PCR的方法扩增得到HSV-TK基因的全长，通过T4连接酶将TK全长连接到PcDNA3.1+/E3⊿6.7k/gp19k以及PcDNA3.1+/E3⊿ADP上，然后采用同源重组法构建M5以及M6。将得到的病毒感染293后提取HirtDNA，然后通过酶切以及PCR的方法鉴定M5以及M6。【结果】将通过PCR方法扩增得到的全长送到测序公司测序后证明其序列是正确的，将以HirtDNA作为模板PCR扩增后得到的产物进行凝胶电泳，在1.2kb处有目的条带存在，将用BanⅢ酶切过的HirtDNA凝胶电泳后在1.2kb左右以及30kb以上可见目的条带。【结论】成功的构建了表达HSV-TK基因的新型选择复制性腺病毒M5以及M6【关键词】选择复制性腺病毒同源重组酶切第二部分两种新型选择复制性腺病毒M5以及M6同Adv-TK体外效应的对比【目的】比较选择复制性腺病毒M5以及M6与Adv-TK的体外效果【方法】Westernblot检测M5，M6以及Adv-TK感染肿瘤细胞以及正常细胞后细胞中TK蛋白的表达量，结晶紫染色检测M5，M6以及Adv-TK对肿瘤细胞以及正常细胞的裂解作用，real-timePCR法检测M5，M6以及Adv-TK在肿瘤细胞以及正常细胞中的复制能力，MTT法以及流式细胞术检测并比较M5，M6以及Adv-TK对各种肿瘤细胞以及正常细胞的杀伤作用。【结果】在肿瘤细胞中，M5以及M6的TK蛋白表达量高于Adv-TK,其中M6的表达量在这三种病毒中最高，而在正常细胞中，Adv-TK的TK蛋白表达量要明显高于M5以及M6，而M6在正常细胞中几乎不表达TK蛋白；结晶紫染色显示Adv-TK对肿瘤细胞没有裂解作用，在腺病毒感染第三天，M5对肿瘤细胞的裂解效应要强于M6，但到感染第五天，M6对肿瘤细胞的裂解作用要强于M5，而即使以很高的MOI感染正常细胞，M5以及M6也不能裂解正常细胞；在腺病毒感染肿瘤细胞后36小时内，M5的复制量要大于M6，36h之后，M6的复制量要大于M5，Adv-TK在肿瘤细胞中不复制，而在正常细胞中，M5，M6以及Adv-TK均不复制；在以高浓度病毒感染肿瘤细胞时，M5，M6以及Adv-TK对肿瘤细胞的杀伤效应相似，但以低浓度病毒感染肿瘤细胞时，M5以及M6对肿瘤细胞的杀伤效应要明显强于Adv-TK，且M6的肿瘤杀伤效应也强于M5，而当M5，M6以及Adv-TK以500MOI感染正常细胞时，M6对正常细胞几乎无杀伤作用，而M5对正常细胞的杀伤作用也明显小于Adv-TK。【结论】在高MOI时，M5，M6以及Adv-TK对肿瘤细胞的杀伤效应相似；在低MOI时，M5以及M6对肿瘤细胞的杀伤能力要明显强于Adv-TK，且M6的肿瘤杀伤效应也强于M5，但M5以及M6对正常细胞的毒性明显小于Adv-TK。【关键词】选择复制性腺病毒裂解效应复制能力杀伤效应第三部分M5，M6以及Adv-TK对裸鼠原位瘤治疗效应的对比【目的】比较选择复制性腺病毒M5，M6与Adv-TK的体内效应【方法】构建裸鼠胃癌原位模型，将Ad5/dE1A,M5和M6以及Adv-TK注入裸鼠体内，并连续14天注射更昔洛韦，每天60mg/kg，比较M5，M6以及Adv-TK对原位胃癌肿瘤的治疗作用及对肿瘤转移的影响，并比较对小鼠生存率的影响，HE染色显示对比肿瘤局部的组织结构，原位杂交检测对比腺病毒在肿瘤局部的复制情况，免疫组化检测对比存在于肿瘤局部的腺病毒的量，Weasternblot法检测肿瘤局部TK蛋白的表达量。【结果】M5和M6以及Adv-TK均可抑制原位肿瘤的生长，但M5以及M6对原位肿瘤的生长抑制作用明显强于Adv-TK，而M6对原位肿瘤的生长抑制作用要强于M5；M5以及M6抑制肿瘤转移的能力也强于Adv-TK；相较于其他治疗组，M6组的局部肿瘤组织中可检测到更多病毒量以及病毒复制，M5组局部肿瘤组织检测到的病毒量也多于Adv-TK组；M5以及M6组中的TK蛋白表达量也高于Adv-TK组；M5以及M6组小鼠生存率明显高于Adv-TK组，且M6组小鼠生存率也高于M5组。【结论】M5以及M6对原位肿瘤的生长以及转移的抑制作用明显强于Adv-TK，且M5以及M6对小鼠生存率的提高也明显高于Adv-TK。【关键词】胃癌原位模型治疗肿瘤转移生存率第四部分M5，M6以及Adv-TK在免疫全能小鼠肿瘤模型中的治疗作用以及代谢情况的对比【目的】比较M5，M6以及Adv-TK对免疫全能小鼠皮下瘤的治疗作用，并对比这三种腺病毒在全能小鼠肿瘤模型中的代谢情况【方法】构建C57BL/6小鼠结肠癌皮下瘤模型，随机分为5组，分别注射PBS，Ad5/