keap1nrf2are信号通路在砷致hacat细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究-dynamic changes and mechanism of kea p1 nrf 2 are signaling pathway in arsenic-induced malignant transformation of ha cat cells.docx

Keap1-Nrf2/ARE 信号通路在砷致 HaCaT 细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究 中文摘要【目的】 无机砷是人类确认致癌物，但由于砷与机体作用十分复杂，加之无机 砷化合物至今尚未成功复制出致癌动物模型，其确切的致癌机制仍未明确。目前砷致 氧化应激机制与砷致表观遗传改变是砷致癌机制的两大热点假说。Keap1-Nrf2/ARE 是机体最重要的抗氧化信号通路，其能够有效地保护机体免受各类氧化损伤。然而， 近年来研究发现该信号通路持续活化则与肿瘤的发生、发展及耐药性密切相关。但该 信号通路在肿瘤发生过程中的不同阶段是如何变化及其变化机制目前尚不清楚。本课 题以低剂量亚砷酸钠(NaAsO2)长期染毒人皮肤角质形成细胞 (Human keratinocyte cell, HaCaT) 诱发恶性转化为载体，研究 ROS 及 Keap-Nrf2/ARE 信号通路相关蛋白 在恶性转化过程中不同阶段的动态变化，进而更深一步探讨导致该信号通路表达变化 可能的分子机制，为砷致癌机制研究提供新思路，同时为为癌症的预防和治疗过程中 合理有效地利用和控制该通路提供新策略。【方法】1. 建立低水平 NaAsO2 长期暴露诱发 HaCaT 细胞发生恶性转化模型： 常规培养 HaCaT 细胞至贴壁并恢复形态后，换用含 0.0 和 1.0μM NaAsO2 的 DMEM 完全培养基连续培养至 35 代 (约 18 周)。在该过程中不同阶段 (21 代、28 代、35 代) 进行细胞生长动力学及 MMP-9 分泌活性检测，软琼脂克隆实验检测其克隆形成能力。 2. 低水平 NaAsO2 致 HaCaT 细胞恶性转化不同阶段 (0、1、7、14、21、28、35 代) Keap1-Nrf2/ARE 信号通路相关指标检测：采用流式细胞仪检测 ROS 水平变化；生化 法检测 MDA 含量及 SOD 酶活力变化；采用 Western-Blot 方法检测细胞总蛋白及核 浆蛋白中 Nrf2、HO-1、Keap1 及 Bach1 蛋白表达水平。3. 低水平 NaAsO2 致 HaCaT 细胞恶性转化中后期 (14、28、35 代) Keap1 基因启动子区 DNA 甲基化检测：提取 相 关 代 数 HaCaT 细 胞 基 因 组 DNA ， 采 用 亚 硫 酸 氢 盐 修 饰 后 测 序 法 (Bisulfite sequencing PCR, BSP)检 测 Keap1 基 因 启 动 子 区 DNA 甲 基 化 情 况 。 4.中文摘要 Keap1-Nrf2/ARE 信号通路在砷致 HaCaT 细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-dC) 处理后各指标检测：将正常 HaCaT 细胞及 1.0μM NaAsO2 诱 导 的 恶 性 转 化 的 HaCaT 细 胞 (T-HaCaT) 分 别 培 养 于 含 有 0 或 10μM 5-Aza-dC 的 DMEM 培养基中 5 天后，采用 BSP 法进行 Keap1 基因启动子区 DNA 甲 基化检测，采用 Western-Blot 法检测 Keap1-Nrf2/ARE 信号通路各蛋白在总蛋白与核 浆蛋白中的表达变化，软琼脂克隆法检测细胞克隆形成能力。【结果】1．用 1.0μM NaAsO2 对 HaCaT 细胞进行连续染毒后发现：随着染毒代数的增加， HaCaT 细胞生长速率逐渐加快，其倍增时间在 35 代时明显少于传代对照组细胞， MMP-9 分泌水平在 35 代也明显升高，染毒 35 代细胞能够在软琼脂中形成明显的克 隆集落，而正常 HaCaT 细胞在软琼脂中几乎不能生长 (p 均0.05)。 2. 对低水平 NaAsO2 致 HaCaT 细胞恶性转化不同阶段 ROS 及 Keap1-Nrf2/ARE 信号通路各相关指 标进行检测发现：在染毒初期 (1 代) HaCaT 细胞内 ROS 水平明显升高，随后到染毒 14 代其表达呈轻微下降后上升趋势，而在 14 代以后随代数增加即恶性程度增加其 ROS 水平逐渐降低，在 35 代时其活力明显低于初代 (0 代) HaCaT 细胞 (p0.05)。 MDA 含量在染毒 1 代时达到峰值，随后呈缓慢下降趋势，但与同代数传代对照组细 胞相比均无统计学差异。在染毒初期 (1 代) 细胞内的 Nrf2 及 HO-1 表达水平和 SOD 酶活力水平均有所上升。随后至暴露 14 代呈现先上升后下降趋势，在砷暴露后期 (21 代以后) Nrf2 在细胞核中持续累积，且 HO-1 表达水平及 SOD 酶活力也呈持续升高趋 势。相反的，Keap1 蛋白表达水平在暴露 14 代以后则呈持续下降趋势。Bach