kl6作为胰腺癌标记物的研究-study on kl6 as a marker of pancreatic cancer.docxVIP

第二章研究材料2.1主要试剂KL-6酶联免疫检测试剂盒BD公司CA19-9酶联免疫检测试剂盒BD公司KL-6单克隆抗体BD公司CA19-9单克隆抗体福州麦新公司2.2实验仪器与设备超低温冰箱日本SANYO公司高速台式离心机上海安亭科学仪器厂超净工作台上海博讯实业有限公司医疗设备厂37℃恒温箱上海福玛实验设备有限公司凝胶成像仪GENEGENIUSSyngene公司石蜡切片机日本莱卡公司光学显微镜Motic公司ELx800uv酶标光度仪BIO-TEKINSTRUMENTSInc光学显微镜Motic公司精密移液器Motic公司第三章研究方法3.1标本采集3.1.1血清标本收集收集正常人、胰腺癌和乳腺癌术前外周血标本各30份,每份5-10ml，EDTA抗凝，2小时内完成3000rpm离心，无菌条件下0.5ML带盖PE管分装，-80℃保存。病人入院前未做治疗（包括放疗、化疗手术等）。依据术后石蜡病理结果，不符合以上三类病例予以剔除。3.1.2组织标本收集收集胰腺癌组织30例，乳腺癌组织30例，选择距离癌灶边缘3cm以上、距离癌灶边缘最远段（或手术切缘处）的组织样本，或胰腺良性肿瘤、胰腺外伤手术切除标本，作为“正常组织”。标本离体后迅速置于液氮中，然后保存于-80℃冰箱备用。3.2.血清KL-6、CA19-9浓度测定KL-6测定标准品的稀释：240ng/L（5号标准品）120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液120ng/L（4号标准品）120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液60ng/L（3号标准品）120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液30ng/L15ng/L（2号标准品）（1号标准品）120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液1)分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。2)弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。3)每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。4)弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。5)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。6)取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。7)测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。8)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。CA19-9测定标准品的稀释：60U/ml（5号标准品）120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液30U/ml（4号标准品）120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液15U/ml（3号标准品）120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液7.5U/ml（2号标准品）120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液3.75U/ml（1号标准品）120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液1)分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。2)弃去液体，甩干，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。3)每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。4)弃去液体，甩干，每孔加满30倍稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。5)每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.6)取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应。7)测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。8)根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。3.3免疫组化1)脱蜡、水化。2)PBS洗两次各5分钟。3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。4)抗原修复。5)PBS洗5分钟。6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4