kl-6粘蛋白在乳腺肿瘤中的测定及其临床意义-determination of kl - 6 mucin in breast tumors and its clinical significance.docxVIP

远处转移无转移11440.7单脏器转移165.7多脏器转移103.6分期I3713.2II5419.3III238.2IV269.3ER（-）3913.9（+）3010.7（++）3010.7（+++）4114.7PR（-）7426.4（+）3612.8（++）155.4（+++）155.4HER-2（-）165.7（+）5620（++）5720.4（+++）113.9试剂(KL-6)ELISA试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司。试剂盒组成及试剂配制：1.酶联板(Assayplate)：一块（96孔）。2.标准品（Standard）：6瓶。（1号：0ng/ml；2号2.5ng/ml;3号5ng/ml;4号10ng/ml;5号25ng/ml;6号50ng/ml）。样品稀释液(SampleDiluent)：1×20ml/瓶。生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibodyDiluent）：1×10ml/瓶。5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidinDiluent）：1×10ml/瓶。6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMBSubstrate）：1×10ml/瓶。9.浓洗涤液（WashBuffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10.终止液（StopSolution）：1×10ml/瓶。免疫组化试剂：KL-6单克隆抗体购自上海蓝基生物科技有限公司。二抗：DAKO二步法抗小鼠免疫组化检测试剂盒，丹麦DAKO公司。显色剂：DABSubstrateChromogenSystem，丹麦DAKO公司。哈氏苏木素染液，伊红染液，美国Sigma-Aldrich公司。CA153测定试剂为罗氏公司配套试剂。CEA测定采用ABBOTTAXSYMPlus全自动化学发光免疫分析仪，试剂为雅培公司配套试剂。ER、PR、HER-2等抗体均购自丹麦Dako公司。1.3主要实验仪器：酶标仪（DENLEYDRAGONWellscanMK2）：Thermo公司产品，产地：芬兰；分析软件：CurveExpert1.3。数字显示隔水式电热恒温培养箱（PYX-DHS）为上海跃进医疗器械厂产品。离心机Eppendorfcentrifuge5810R：德国Eppendorf公司。离心机BeckmanCoulterTMmicrofuge?22Rcentrifuge：美国BeckmanCoulter公司。DHG-101系列电热恒温鼓风干燥箱：上海华连医疗器械有限公司。STS-2型脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司。Sigma1-14型离心机：德国Sartorius公司。QL-861型振荡混合器：江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。AS-20-04-80型高压锅：上海爱仕达电器有限公司。RH-KT/C型磁力搅拌器：广州IKA公司。1000μl，100μl，2μl移液枪：法国Gilson公司。全自动电发光免疫分析仪：罗氏和雅培公司。2实验方法2.1血浆样本采集所有患者于手术前或化疗前，在晨起空腹时（禁食12小时以上）抽取全血3ml，置入3.2%枸橼酸钠抗凝管。4℃保存。于24小时内离心，取上清液分装后即置于-80℃冰箱保存待测。随机选择健康对照组70例，于空腹情况下抽血。部分患者化疗后以同样方法进行采血保存。2.2免疫组化样本采集手术或粗针穿刺活检后病理科统一采集，做成石蜡切片常温保存。乳腺癌组织全部行ER、PR、HER-2检测。其中40例乳腺癌组织再予KL-6免疫组化，同时选取其中20例癌旁组织（定义为癌组织旁3cm以上正常组织，因为正常乳腺组织一般无法获得）作为对照。另外，再选取20例乳腺纤维腺瘤组织也同时进行KL-6免疫组化作为对照。2.3实验室指标测定KL-6定量ELISA测定步骤ａ．准备试剂1.洗涤液：用双蒸水1:20稀释。2.标准品及样品准备：分别标记标准品，样品编号。将标准品，样品各100μl移入备用96孔板。ｂ．检测步骤1.建立标准曲线：抗体包被的微孔板上设标准孔7孔（A1-G1），按0，2.5，5.0，10,25,50ng/ml的浓度顺序，每孔中各加入标准品100μl。H1孔为空白对照。2.加样：待测样品孔中每孔加入待测样品100μl。3.在标准品孔和样品孔中加入50μl酶标记偶合液。轻柔摇晃15秒。4.将反应板置37℃水浴60分钟。5.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤5次，每次静置10-20秒。向滤纸上印干。6.每孔中加入底物A、B各50μl。7.37℃下避光孵育反应15分钟。8.每孔加入50μl终止液，终止反应。9.轻摇30秒，使充分混合变色15分钟内在450nm处测吸光值。ｃ．