klebsiella sp. hq 3产氢代谢调控及其发酵制氢的条件优化-regulation of hydrogen production metabolism in klebsiella sp. hq 3 and optimization of fermentation conditions for hydrogen production.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要厌氧发酵产氢与其它产氢技术相比，具有反应条件温和、反应器设计简单、产氢效率相对较高、能够将各种廉价的有机废弃物转化为能源等优点，因此成为当前能源领域的研究热点。然而，自然界中野生菌株产氢效率低一直是厌氧发酵产氢工业化亟待解决的关键问题。敲除产氢代谢负调控因子或其竞争途径的关键酶基因；利用辅酶工程策略调控产氢微生物的代谢方向及优化产氢发酵关键参数是解决这一瓶颈问题的有效途径。克雷伯菌作为兼性厌氧发酵细菌具有底物适应性强，培养容易，产氢潜力较高的特性。到目前为止，利用该菌进行产氢研究的相关报道主要集中于优化产氢发酵条件和寻找廉价底物等方面，而利用基因工程手段提高其产氢能力的研究少见。在此背景下，本研究以前期本实验室筛选出来的克雷伯菌Klebsiellasp.HQ-3作为出发菌株，通过敲除与产氢有竞争作用的产琥珀酸途径关键酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC,phosphoenolpyruvatecarboxylase）基因和过表达合成NADH过程中的NAD合成酶达到提高产氢效率的目的，并初步探索该菌产氢代谢机理；在此基础上，进一步运用响应面法优化其发酵过程中的显著因子，确定了工程菌最佳的产氢培养条件。具体研究内容和结果如下：（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的敲除。运用简并PCR，以克雷伯菌HQ-3基因组为模板，扩增得到编码产琥珀酸代谢途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc。利用Red重组系统敲除ppc基因，获得的工程菌命名为HQ-3-P（Δppc）。产氢发酵对比实验表明工程菌HQ-3-P的产氢效率为0.762molH2/mol葡萄糖，比野生菌的产氢量增加24.21%。（2）来源于产气肠杆菌的NAD合成酶的过表达。将含NAD合成酶基因（nadE）的表达载体pET28-pkan-nadE分别电转到野生菌株HQ-3和重组菌HQ-3-P中，得到异源表达菌株HQ-3-N(nadE)和HQ-3-P/N(Δppc/nadE)。发酵结果表明，表达NAD合成酶的菌株生长速率均有所提高，其中表达了NAD合成酶的工程菌的产氢效率由0.762molH2/mol葡萄糖提高到0.786molH2/mol葡萄糖，而表达了NAD合成酶的野生菌的产氢效率由0.581molH2/mol葡萄糖提高到0.620molH2/mol葡萄糖。（3）发酵条件优化。通过单因素实验得到接种量、初始pH和温度为工程菌HQ-3-P产氢发酵过程中的显著因素，实验结果表明在不考虑交互作用的前提下，接种量20%，初始pH7.0，发酵温度33℃为最适条件。在此基础上，运用响应面法，采用CentralCompositeDesign(CCD)设计实验条件，响应值利用统计学软件Design-Expert8.0.5进行分析、预测，得出最优发酵条件：温度为31.81℃，接种量为21.03%，初始pH值为7.14。通过实验验证得到的实际产氢效率为1.125molH2/mol葡萄糖，与预测值1.111molH2/mol葡萄糖吻合。关键词：厌氧暗发酵产氢克雷伯菌ppc基因敲除异源表达响应面法优化AbstractFermentativehydrogenproductionhasadvantagesofrapidhydrogenproductionrate,simpleoperation,mildreactionconditionandbioconversionfeasibilityfromvariousorganicwastesincomparisonwithotherhydrogenproductiontechnologies.Therefore,ithasbeenreceivingincreasedattentioninrecentyears.However,lowhydrogen-productionyieldofwildstrainsblocksindustr