维持性血透患者透析前后湿浊变化与调节性T细胞关系.docVIP

维持性血透患者透析前后湿浊变化与调节性T细胞关系 　　【摘要】 目的 检测维持性血透患者透析前后调节性T细胞（Treg）的水平变化，通过其水平的变化，探讨其与中医湿浊的关系；观察透析前后湿浊症状的变化情况，了解透析能否改善湿浊症状。方法 采用三色荧光染色通过流式细胞仪(FCM)分析外周血中CD4+CD25+CD127lo细胞水平。结果 ①血液透析前、后Treg较正常组显著减少(P0.05;尿素氮(BUN)、血磷(P),P 　　【关键词】 尿毒症；CD4+CD25+CD127lo；流式细胞术；血液透析；湿浊? 　　【中国分类号】 R692.5【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0414-01?? 　　 目前我国大部分尿毒症的患者都依靠血液透析来维持生命，血液透析的主要是将患者的血液从血管里抽出来，通过透析器（也叫人工肾）的装置将体内的毒素排出，同时将过滤过的血液回输患者体内［1］。本文旨在探讨维持性血透患者透析前后湿浊变化与调节性T细胞的关系。? 　　1 临床资料? 　　1.1 尿毒症透析组:尿毒症透析组为福建省人民医院血液透析室行血液透析治疗半年以上的慢性肾功能不全患者，共25例，其中男性18例，女性7例，年龄（59.4±15.8）岁（26~86岁），透析时间（10~96月），其中慢性肾小球肾炎18例，糖尿病肾病7例。所有患者均行常规碳酸氢盐透析，透析时间4h/次，2~3次/周，使用普通肝素抗凝，透析器为Polyflux LR膜，膜面积1.2~1.5m2，血液流量200~250ml/min，透析液流量500ml/min，所有患者均使用促红细胞生成素（EPO）治疗，100~150IU（Kg.w）。? 　　1.2 排除标准: 病因为肿瘤性疾病以及全身免疫系统疾病所致继发性肾脏损害，近期患有感染性疾病，以及使用影响免疫功能药物的患者。? 　　1.3 正常对照组： 来自健康志愿者，经体检及理化检查，评定无心、脑、肝、肾、肺和内分泌等主要器官系统的实质性病变，共21例，男6例，女15例，年龄23~44（26.7±4.6）岁。? 　　1.4 外周血调节性T细胞测定：① 标本采集 正常体检者分别于清晨空腹抽取肝素抗凝血2ml（肝素浓度25U/ml）1管，促凝管2ml 1管。血液透析患者分别于透析前、透析后下机时血路动脉端抽血，所有标本均于采集后1h内处理分析。②实验试剂 FITC标记CD4、PE标记CD25、Alexa Fluor 标记CD127抗体，试剂盒均购自美国BD公司。③ CD4+、CD4+CD25+CD127loT细胞的检测：（1）肝素抗凝血2ml(肝素浓度25U/ml)，用PBS液1:1稀释，取稀释后的血3ml缓慢加入3ml的淋巴分离液管中，2500r/min离心20min；离心完毕，收集中间层白色云雾状细胞，用2ml PBS液,振荡混匀，1200r/min离心5min， 弃上清液，再用2ml PBS液,振荡混匀，1200r/min离心5min后弃上清液。（2）取Buffer液和蒸馏水按1:9比例稀释；每管弃上清液后的标本中加入稀释好的Buffer液200μl混匀，分2管，其中1管为阴性对照管，加入FITC标记的CD4抗体20μL，混合均匀；另设一管为阳性管，分别加入CD4抗体， CD25抗体， CD127抗体各20μL，混合均匀。 （3）经上述步骤后完成单细胞悬液的制备和染色，避光静置15分钟，避光完毕后每管分别加入Buffer液400μl，上流式细胞仪检测。分析过程如下（分析结果见图1）。分析过程如下（分析结果见图1）。a.以FSC为横坐标，侧向散射角（SSC）为纵坐标，将外周血单个核细胞分群，分为中性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和细胞碎片，确定淋巴细胞群。b.在淋巴细胞中以CD4设门，将淋巴细胞分为CD4+T淋巴细胞和CD4-淋巴细胞，计算出CD4+T淋巴细胞占淋巴细胞的比例。c.在CD4+T淋巴细胞中，以CD25设门，计算出CD4+CD25+T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞的比例。d.在CD4+CD25+T淋巴细胞中，以CD25、CD127设门，计算出CD4+CD25+CD127loTreg占CD4+T淋巴细胞的比例。③ 中医辨证分型标准［2］：根据卫生部《中药新药临床指导原则》中尿毒症的中医辨症分型标准，脾肾阳虚证：主症：畏寒肢冷，倦怠乏力，气短懒言，食少纳呆，腰酸膝软。次症：腰部冷痛，脘腹胀满，大便不实，夜尿清长，舌淡有齿痕，脉沉弱。湿浊证：主症：恶心呕吐，肢体困重，食少纳呆。次症：脘腹胀满，口中粘腻，舌苔厚腻。? 　　2 结果? 　　2.1 血液透析前CKD Ⅴ组、CKDⅢ-Ⅳ、正常组Treg、BUN、P水平变化? 　　 血液透析前、CKDⅢ-Ⅳ组Treg较正常组