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大孔吸附树脂分离纯化荷叶中荷叶碱 　　摘要：目的：优化大孔吸附树脂分离纯化荷叶中荷叶碱的洗脱条件。方法：用D101大孔吸附树脂进行分离纯化，20%～70%的乙醇梯度洗脱，并采用HPLC对其中的荷叶碱进行含量测定。结果：采用50%～70%的醇梯度洗脱后荷叶碱的总收率达1.3%。结论：此方法操作简单，重复性好，用50%～70%的乙醇进行梯度洗脱，能有效的提纯、富集荷叶中的荷叶碱。 　　关键词：荷叶碱；D101大孔吸附树脂；梯度洗脱；含量测定 　　中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0877-03 　　 　　荷叶为睡莲科植物莲（Nelumbl nuciferea Gaertn）的叶，具有清热解暑、升发清阳、凉血止血之功。《本草纲目》载“荷叶服之，令人瘦劣”，现代临床广泛应用于肥胖症及高血脂症[1]。荷叶碱是荷叶中的一种阿朴啡类生物碱，药理作用研究表明荷叶碱为荷叶中的主要降脂活性成分[2-3]。荷叶碱的需求量??不断的增加，但是目前缺少方便有效的制备较纯荷叶碱的方法，限制了对荷叶资源进一步的开发和利用。本实验采用70%的乙醇提取，大孔吸附树脂分离纯化，高效液相对其进行含量测定，为荷叶的开发提供理论依据。 　　 　　1实验材料 　　 　　FA1004上皿电子天平（上海天平仪器厂）,SHZ-3（Ⅲ）型循环水多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）,旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）,真空干燥箱（天津天宇仪器有限公司）,高效液相色谱仪Waters 515（上海Waters公司）,荷叶碱标准品（购于中国药品生物制品检定所）,D101大孔吸附树脂（天津海光化工有限公司）,HPD―100 大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司) 。 　　 　　2荷叶总生物碱的提取与纯化 　　 　　2.1药材的含量测定由于从不同药房购买的荷叶的质量不同，其荷叶碱的含量也不一样，所以为了取得最佳试验效果，本试验在实验前先对荷叶进行了筛选。通过HPLC测定了不同批荷叶中荷叶碱的含量，具体测定方法见2005版《中国药典》上的方法[4],测定结果，见表1，由表中测得的结果可知B荷叶可作为本试验用荷叶。 　　 　　2.2荷叶生物碱的提取称取碱荷叶，切成细丝，加70%的乙醇30倍量，浸泡30min，回流提取两次，每次2h,过滤，回收乙醇，抽滤，置蒸发皿中，水浴挥至无醇味处备用。 　　2.3树脂的预处理及树脂柱的净化大孔吸附树脂D101和HPD-100，先用95%的乙醇浸泡24h，装柱后先用95%乙醇洗至无浑浊，再用蒸馏水洗，洗至无醇味后备用。净品树脂D101则可用蒸馏水浸泡后直接装柱使用。 　　2.4树脂的筛选用HPD-100[5]和D101大孔树脂作比较，其相同条件下平行实验测得的结果。见表2，本实验表明选择用D101大孔吸附树脂纯化较好。 　　 　　2.5洗脱剂的选择前期实验以紫外为检测方法表明[6]，用梯度洗脱比用单一浓度溶剂洗脱效果好，荷叶碱的回收率较高，所以采用20%～70%的乙醇梯度洗脱。 　　2.6荷叶总生物碱的分离纯化荷叶总生物碱的分离纯化，用净品树脂D101处理后装柱使用。将制备好的荷叶生物碱溶液与中性氧化铝拌干后加入，调整树脂柱流速≤1d/s。水-乙醇梯度洗脱，直到洗脱液中检测无生物碱（检测终点：加碘化铋钾无桔红色沉淀，加硅钨酸无灰白色沉淀）浓缩成稠膏，然后50℃减压干燥,即得总生物碱。 　　 　　3荷叶碱的含量测定 　　 　　3.1色谱条件色谱柱，Symmetry-18(4.6mm×250mm);流动相，乙腈∶水∶三乙胺∶冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速，1mL/min；检测波长：270nm；柱温：25℃。 　　3.2溶液制备对照品溶液：精密称取荷叶对照品1.35mg置10mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，再精密吸取1.0mL置10mL量瓶，甲醇定容至刻度，配制成浓度为13.5μg/mL的溶液。供试品溶液：将生物碱粉末精密称取适量，置25mL的容量瓶中，用流动相溶解，超生助溶,充分溶解后，微孔滤膜滤过，备用。 　　3.3线性关系的考察精密吸取荷叶碱对照品溶液（0.135mg/mL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别精密吸取20μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y=5.26×104X+3.58×104，r=0.9992。表明荷叶碱在6.75～33.75μg/mL范围内具有良好的线性关系。 　　3.4精密度考察精密吸取对照品溶液（13.5μg/mL）20μL，重复进样5次，荷叶碱峰面积的