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一个新的视网膜色素变性的连锁位点RP33，以及RP11连锁家系中PRPF31基因完整突变筛查 天津医科大学博士研究生毕业论文 摘要 一个新的视网膜色素变性的连锁位点RP33,以及RPll连 锁家系中PRPF31基因的完整突变筛查 研究目的: 分析两个常染色体显性视网膜色素变性autosomaldominantretinitis pigmentosa,adRP家系AA、AB的临床表型特征并研究其遗传学病因?通过全 基因组连锁分析首先进行家系疾病的遗传学定位,然后在连锁区内进行候选基 因突变筛查。 1.研究两个adRP家系AA、AB的福床表型特征。 2.通过全基因组扫描连锁分析确定两个adRP家系致病基因的染色体定位。 3.通过基因序列分析对连锁区内一系列可能的候选基因进行突变筛查,寻找致 病基因。 4.通过新技术多重连接依赖探针扩增MutiplexLigation-DependentProbe Amplication,MLPA反应和单核苷酸多态性Singlenucleotidepolymorphism, SNPs检测对冠P』J连锁家系AB进行候选基因PRPF31基因巨大缺失突变筛 查。 研究方法: 1.临床研究方法: 1.1眼科常规检查 包括询问病史,屈光状态、眼前节裂隙灯检查,直接和间接眼底镜检查以 及眼底照相等。 1.2特殊检查方法 包括视野检查Humphrey750,明、暗适应视网膜电图electrorctinogram, 天津医科大学博士研究生毕业论文 ERG以及多焦视网膜电图mllltifocalERG检查等。 ● 2. 分子遗传学研究方法: 2.1取家系成员外周静脉血5-8ml,采用RocheBiochemieal公司的DNA分离 试剂盒提取基因组DNA。 2.2遗传连锁分析 2.2.1全基因组扫描连锁分析 在全部常染色体范围内选取370对荧光微卫星标记物进行全基因组扫描, 相邻微卫星标记物之问的平均距离为10厘摩Centimorgan,cM。利用聚合酶 链反应PolymeraseChainReaction,PCR扩增全部370对荧光微卫星标记物。 利用ABI377XLDNA测序仪读取370对微卫星标记物等位基因片段大小并利 用Genescan3.1和Genotyper2,0软件进行单体型分析。运用SimWalk22.89, Version3.35软件计算计算疾病表型与多个微卫星位点之间的多点最大优势对 数LOD值。 2.2.2精确连锁定位 在通过全基因组连锁分析取得疾病基因在染色体上的初步定位以后,在取 得最大正数LOD值的初步定位区域内进一步选取荧光标记微卫星标记物,以缩 小并精确连锁区域临界范围。标记物之间的平均距离为lcM。 23基因序列分析 根据连锁分析的结果,分别在AA和AB两个家系所定位的染色体候选区 内选取侯选基因,并用ABI3730GeneficAnalyzer对侯选基因进行直接基因序 列分析。 2.4PRPF31基因的巨大突交筛查 在AB家系中对P足P乃J基因进行SNPs和MLPA检测以筛查潜在的巨大 基因缺失突变即基因半合子状态hcmizygollsity。 研究结果: 1.AA家系 临床上,AA家系中的患者以夜盲起病,发病年龄较晚,表现为进行性视 Ⅱ 天津医科大学博士研究生毕业论文 力下降和周边视野缺损。RP临床表现在家系患者之间甚至同一患者的双眼之间 均具有较大的变异,致病基因外显不全。 通过全基因组连锁分析在排除了所有已知adRP连锁位点之后,在2号染 色体长臂上确定了一个新的adRP连锁位点魁i站OMIM%。在微卫星 标记物D2S2222取得最大多点LOD值4.69,通过家系中的两个正常同胞身上 发生的重组recombinant可将RP33位点定位于微卫星标记D2S2159和 D2S1343之间约4.8cM的区域染色体带2cen-q12.1内。 对RP33区域中的候选基因SEMA4C,C:Ⅳ翻3和HNKlST以及紧邻兄阿3 区域的一个已知arRP相关基因MERTK进行序列分析未发现任何致病突变。 2.AB家系 AB家系在临床上属弥漫型RP表型且具有较高外显率。此外,家系中有13 名患者还同时具有皮质型白内障表型。 通过全基因组连锁分析和进一步的精确定位将此家系致病基因定位于染色 体区19q13.4C足P,JOMIM#,微卫星标记物D19S924和D19S880 之间约5.71cM区域内。 对连锁区内的已知adRP基因PRPF31进行完整的突变筛查基本排除了 列妒丹J全部阅读框架范围内的突变。进一步在连锁区域内选取其它候选基因 纠tKCG、甲r,邪EM彳,舢,和U2AF2进行直接测序未发现致病性突变。 结论: 1.AA和AB家系属于常染色体显性遗传视网膜色素交性家系. 2.通过从家系定位了