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H9c2心肌细胞多巴胺受体表达 　　黄建军　刘洪波　徐　霞　张捷平　刘辰庚　肖敬川　宋惠萍 　　摘要：为明确H9c2心肌细胞是否能够表达多巴胺受体(dopamine receptor,DR)，应用RT-PCR和Western blot-ting分别检测H9c2心肌细胞和SD成年雌鼠左心室心肌组织中，DR的两种亚型，D1DR和D4DR的表达，结果发现，H9c2心肌细胞可在mRNA和蛋白水平上表达出与SD大鼠心肌组织相同的产物，这说明能以H9c2心肌细胞为研究材料，进一步深入研究心肌DlDR和D4DR基因的表达调控机制以及心肌DR的功能。 　　关键词：多巴胺受体；心肌细胞；表达 　　中图分类号：R34 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)02-0139-04 　　 　　多巴胺受体(dopamine receptor，DR)为7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族的成员，属于视紫红质类家族，目前已分离出5种DR，根据生化和药理学特性，可分为D1样和D2样受体，Dl样受体包括D1DR和D5DR两种亚型，可激活腺苷酸-环化酶－cAMP-蛋白激酶A途径；D2样受体包括D2DR、D3DR、D4DR 3种亚型，与D1样受体的作用相反，抑制上述信息途径的活化，DR广泛分布于中枢神经系统及外周多种组织，如人和大鼠心肌及冠脉均已检测到DR的表达，据本室研究报道，与假手术组比较，去势大鼠心肌D1DR和D4DR的转录表达水平发生显著改变，本研究拟采用RT-PCR和Western blotting技术，检测大鼠心肌细胞系H9c2和SD大鼠左心室心肌组织内，D1DR和D4DR的mRNA和蛋白的表达。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1材料 　　大鼠胚胎心脏来源的细胞株H9c2购自American type culture collection公司，DMEM培养液、胎牛血清购自GIBCO公司，青链霉素购自Sigma公司，Trizol购自美国Invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒购自Promega公司，兔抗大鼠D4DR多克隆抗体购自Calbiochem公司，羊抗大鼠D1DR多克隆抗体、抗actin抗体以及HRP-标记的二抗均购自Santa cruz公司，Ecl WesternBlotting检测试剂盒购自Amersham公司。 　　 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养 　　大鼠心肌细胞H9c2培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃，5％CO2的条件下培养，待细胞生长至90％单层时传代。 　　1.2.2 RT-PCR 　　应用Trizol试剂提取SD雌鼠心肌和H9c2细胞总RNA，依A260和A280数据判断RNA的纯度及含量，两步RT-PCR法扩增靶序??，按逆转录常规方法合成cDNA第一链，反应体系包括经脱氧核糖核酸酶(DNase)处理过的总RNA 1μg，Oligo(dT)161μL，5×逆转录反应缓冲液4μL，RNA酶抑制剂1μL，dNTP(10mmol/L)2μL，AMV逆转录酶200u，于42℃反应60rain，70℃，10min终止反应，-20℃保存备用，取1μLcDNA为模板进行PCR扩增，条件为：10mmol/LTris-HCl(pH8.3)，50mmol/LKCl，1.5 mmol/LMgCl2，dNTP200μmol/L，引物0.5μmol/L，0.025U/μLTaqDNA聚合酶，D4DR上游引物为5′-ac-、cetactcagggtcccctct-3′，下游引物5′-gatcttggcgc-ctctctnc-3′；D1DR上游引物为5′-agatgacccc-caaagcag-3′，下游引物5′-acgtectgctcaaccttg-3′；同时选用GAPDH作为内标，GAPDH上游引物为5′-accacagtccatgceatcac-3′，下游引物5′，tccaccaccct-gttgctgt-3′，PCR反应条件为：94℃5 min：94℃30s，退火30s，72℃1min20s，33个循环：72℃10min，反应结束后取20PCR产物，1.5％琼脂糖80V电泳20min，凝胶成像系统照像。 　　1.2.3心肌组织和H9c2细胞总蛋白的提取和蛋白质免疫印迹检测 　　取成年大鼠左心室样品，液氮内研磨，加入全细胞裂解液，冰上处理30rain，4℃12000g离心15min，取上清采用Bradford法进行蛋白质定量，细胞总蛋白的提取为直接在细胞培养瓶内加入细胞裂解液后，处理同上，取50μg总蛋白样品于，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印至硝酸纤维素膜，用10％无脂牛奶37℃封闭1h，抗D1DR抗体(Santa，1：500)或抗D4DR抗