大豆Em(LEA1)蛋白保守结构域结构和聚集特性.docVIP

大豆Em(LEA1)蛋白保守结构域结构和聚集特性 　　摘 要 采用圆二色谱（CD）和核磁共振波谱（NMR）方法研究了大豆Em（LEA1）蛋白保守基序Em?C和?Em?2M多肽在不同环境中的结构及聚集行为?。研究表明，在水和DMPG溶液中，两种多肽主要以无规结构形式存在。在50% TFE 溶液中，Em?C多肽折叠结构增加，含疏水残基的部分区域可能形成?α??螺旋结构，且分子以二聚体形式存在；而Em?2M则以单体形式存在，且有序结构较少。以上结果表明，环境变化可能导致两种多肽的空间结构和聚集行为改变，这有助于理解Em蛋白在不同环境中的结构特点，及其重要区域在全长蛋白中所起的作用。 　　关键词 晚期胚胎发生富集（LEA1）蛋白； 核磁共振； 结构； 聚集? 　　 　　1 引 言? 　　晚期胚胎发生富集（Late embryogenesis abundant，LEA）蛋白是一类与植物抗逆反应相关的重要蛋白质。根据其表达模式和序列特点，可将其分为7组??\?。其中第一组LEA蛋白（简称为LEA1）全长序列高度保守，富含甘氨酸和带电氨基酸，且在氨基端、中部和羧基端分别存在不同20氨基酸基序??\?。LEA1蛋白主要存在于植物界中，在一些细菌和甲壳纲动物，如丰年虾等生物体中也发现了此类蛋白??\?。已有研究表明，小麦PM1959、大豆Em和小麦TaEm蛋白（LEA1）的表达可以提高多种生物（如转基因植物、酵母和大肠杆菌重组子）对干旱、高盐和渗透等胁迫的耐受性??\?。体外实验证明，小麦Em和大豆Em等（LEA1）可保护乳酸脱氢酶（LDH）或柠檬酸合成酶免于因高温、干燥和冰冻胁迫所引起的酶活性丧失??\?，LEA1蛋白可能具有多重保护功能。因此，揭示LEA1蛋白的保护功能，理解其作用机理，可为有效利用LEA基因，培育抗逆植物新品种提供重要的基础资料。? 　　在天然状态下，LEA蛋白为无规结构蛋白??\?。Tunnacliffe等??\?指出，LEA蛋白结构的可塑性可能是实现多功能的重要基础。在水溶液中, LEA1蛋白多以自由卷曲和少量?α??螺旋结构存在。当遇干燥胁迫或在醇溶液中，LEA1蛋白的?α??螺旋含量增多，预示着LEA1蛋白的?α??螺旋结构将参与对细胞的保护作用??\?。小麦Em蛋白（LEA1）N端的?α??螺旋结构对经干燥胁迫的酶活性的保护作用是必需的??\?。因此，研究LEA1蛋白和其重要结构域的结构及其随环境的变化，有助于揭示在各种环境胁迫下LEA1蛋白与其它分子间可能发生的相互作用，及保护生物大分子等过程。? 　　大豆Em蛋白属LEA1蛋白，可编码105个氨基酸，其中的第44～63位氨基酸为保守的中部20?氨基酸基序（Em?M区），该基序前面有43个氨基酸片段（Em?N区），基序后面有42个氨基酸片段（Em?C区）。本课题组最近报告，大豆Em蛋白全长蛋白、Em?C、Em?2M（含2个M区）和Em?N片段的表达均可赋予重组大肠杆菌对高盐的耐受性，而且还可以通过稳定LDH酶蛋白结构、阻止其聚集而保护冻融胁迫下的LDH酶活性??\?。? 　　为了认识Em蛋白和其保守结构域的结构，及其随环境变化的特点，并为进一步理解其重要区域在全长蛋白中所起的作用提供有用的结构信息，本研究采用圆二色谱（CD）和核磁共振波谱（NMR）方法研究了Em?C和Em?2M多肽在水、50% TFE溶液和阴性脂质体（DMPG）等不同环境下的结构和聚集行为。2 实验部分? 　　2.1 材料? 　　多肽Em?C和Em?2M（表1）的表达、纯化及鉴定参见文献 \。氘代三氟乙醇（TFE?d?2；98%，Cambridge Isotope Laboratories公司）；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG，Avanti Polar Lipids Inc公司）；氯仿和甲醇（东莞市东江化学试剂有限公司）。 　　表1 多肽氨基酸序列（50个氨基酸）? 　　Table 1 Sequence of peptides （50 amino acid） 　　M domain of soybean LEAI protein Em （Em?2M）GSHMASGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSC domain of soybean LEAI protein Em （Em?C）GSHMASGGLSTVDKSGEERAQEEGIGIDESKFRTGNNKNQNQNEDQDKTS 　　2.2 分析方法? 　　2.2.1 远紫外圆二色谱（Far?UV CD） （1）样品制备 A. 水溶液中样品：将适量肽直接溶于20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）中，使肽的终浓度为7 　　 　　mol/L?，磷脂与肽的浓