恶性转化beas-2b细胞lncrnas与 mirnas的差异表达-differential expression of lncrnas and mirnas in malignant transformed beas - 2b cells.docxVIP

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：摘要目的长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)在一定范围内调控着生物功能的延续或中断，其差异表达已被认为是肿瘤的一个标志性特征。微小RNA(microRNA,miRNA)可负向调节基因表达，且可与lncRNAs相互作用。本研究旨在探索致癌物诱导的永生化人支气管上皮细胞(immortalizedhumanbronchialepithelial,BEAS-2B)lncRNAs和miRNAs的差异表达，为进一步的机制研究提供依据。方法1.以煤焦沥青烟气提取物(coaltarpitchextracts,CTPE)、烟草烟雾凝集物(cigarettesmokecondensate,CSC)为染毒物，处理BEAS-2B细胞，体外构建细胞恶性转化模型。以苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]为阳性对照，染毒浓度5μg/mL；二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)为溶剂对照，染毒浓度2‰；CTPE及CSC染毒浓度分别为2.4μg/mL与25μg/mL。通过细胞形态学观察、划痕实验、克隆形成实验、细胞增殖活力及凋亡率检测评估细胞是否发生恶性转化。2.对空白对照组和分别经B(a)P及CTPE诱导的恶性转化BEAS-2B进行LncRNA/mRNA表达谱芯片及MicroRNA表达谱芯片检测。3.生物信息学方法筛选差异表达lncRNAs及miRNAs，并进行realtime-PCR验证。结果1.体外恶性转化细胞模型建立BEAS-2B细胞对于CSC的半数抑制浓度(medianinhibitoryconcentration,IC50)约为0.084mg/mL。B(a)P、CTPE、CSC染毒20代、30代细胞镜下轮廓模糊，胞内出现空泡，细胞膜肿胀变形，出现畸变的细胞核等。划痕实验结果显示B(a)P、CTPE、CSC染毒细胞迁移距离均大于DMSO组细胞(均P0.05)；B(a)P、CTPE、CSC组细胞克隆形成数均高于DMSO组(均P0.05)，随代数增加，克隆形成数也增加(均P0.05)；细胞增殖活力实验结果显示B(a)P、CTPE、CSC染毒细胞吸光度值均大于DMSO组(均P0.05)，随代数增加，细胞增殖活力增大(均IP0.05)；凋亡率检测发现B(a)P、CTPE、CSC染毒细胞凋亡率均小于DMSO组(均P0.05)，且随细胞代数增加，凋亡率下降(均P0.05)。LncRNA/mRNA表达谱芯片检测结果以Foldchange≥1.5，P0.05进行差异lncRNAs筛选，B(a)P30组中检出差异表达lncRNAs263种，其中，较之空白对照组表达上调的有159种，下调104种；CTPE30组中有707种lncRNAs差异表达，其中，有408种表达上调，299种下调；且差异表达lncRNAs中antisense与intergenic两类比例较高。以Foldchange≥1.5，P0.05进行差异mRNAs筛选，B(a)P30组中共检出差异表达mRNAs159种，其中，表达上调的有99种，60种下调；CTPE30组中有569种mRNAs差异表达，其中，有357种上调，212种下调。MicroRNA表达谱芯片检测结果利用Foldchange≥2.0，P0.05进行差异miRNAs筛选，B(a)P30组中共检出差异表达miRNAs127种，其中，较之空白对照组表达上调的有29种，98种下调；CTPE30组中有78种miRNAs差异表达，其中，有52种表达上调，26种下调。Realtime-PCR验证结果与空白对照组及DMSO组相比，B(a)P、CTPE、CSC处理组lncRNAs中有ENST00000501520、ENST00000556926、ENST00000535078表达上调，TCONS达下调；miRN