肺结核患者外周血中分泌il-9的淋巴细胞亚群的探讨-study on lymphocyte subsets secreting il - 9 in peripheral blood of pulmonary tuberculosis patients.docxVIP

肺结核患者外周血中分泌IL-9的淋巴细胞亚群的探讨?中文摘要研究背景：-9长期以来被认为是由TH2类细胞产生的，可作用于多种炎症细胞和组织细胞，产生不同的生物学效应，在过敏性哮喘和寄生虫感染中发挥重要作用。IL-9既是一种T细胞生长因子，又可作用于B细胞，在免疫球蛋白的调控中发挥作用。TH9是新发现的CD4+T细胞亚群，可由TGF-β和IL-4联合刺激CD4+初始T细胞产生，也可直接由TGF-β作用于TH2细胞，而由TH2细胞分化而来。近来研究发现，除TH9细胞外，Treg细胞和TH17也可产生IL-9，那么CD8细胞、γδT细胞及其它淋巴细胞亚群是否也产生IL-9？IL-9与IL-17是否有共分泌现象，目前还不太清楚。有研究报道表明，结核病人的外周血中IFN-r,IL-12a,IL-12β和IL-23mRNA的表达水平降低，而IL-9mRNA的水平显著升高。通过加入外源性的IL-9可抑制IFN-rmRNA的表达，中和IL-9可恢复IFN-rmRNA的表达，这表明IL-9通过抑制TH1细胞细胞因子的产生，从而抑制了TH1细胞抗结核的功能。在结核病人中，哪些淋巴细胞亚群产生IL-9呢？目的：通过检测肺结核患者外周血各淋巴细胞亚群产生-9及其相关因子的比例，来探讨产生IL-9细胞亚群与结核病的关系，为深入研究结核病的发病机制奠定基础。流式细胞术检测IL-9分泌细胞的方法学探讨。方法：1.采集23例健康志愿者和26例活动期结核病人外周血，加入佛波醇酯（PMA）和钙离子酶素(IM)刺激培养6小时，在后4小时加入阻滞剂莫能霉素（Mo）,刺激结束，收集细胞，加入相应荧光标记的单克隆抗体进行染色，用流式细胞仪检测分泌IL-9、IL-17及IFN-r的淋巴细胞亚群比例；2.制备Mtb-HAg:收集对数生长期的结核杆菌，高压灭菌处理制备成Mtb-HAg；3.采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），用Mtb-HAg和rIL-2刺激培养扩增效应性γδT细胞（Mtb-AT），8-11天后，收集细胞用PMA/IM和Mo以及Mtb-HAg和Mo刺激培养后，加入相应的荧光标记单克隆抗体，用流式细胞仪检测分泌IL-9和IFN-r的γδT细胞亚群比例；4.采用同一个体的全血和PBMC同时用PMA/IM和Mo刺激培养流式细胞仪检测分泌IL-9淋巴细胞亚群比例；5.采用同一个体的全血离心收集上清用ELISA检测IL-9的含量；6.PBMC提取RNA,逆转录cDNA,PCR检测IL-9的mRNA表达。结果:1.结核（TB）病人和健康者(HD)外周血分泌IL-9的T淋巴细胞亚群比例比较，TB病人和HD在CD3中比例分别为0.32%和0.35%,在CD4中比例分别为0.21%和0.22%，在CD8中比例分别0.35%和0.32%均无显著差异，而在γδT中比例分别为2.93%和1.07%，TB病人的γδT分泌IL-9比例显著升高(P0.01)。2.TB病人和HD外周血NK细胞及B细胞分泌IL-9的比例比较，HD在NK细胞和B细胞中比例分别为0.34%和0.12%，HD组NK细胞分泌，B细胞少许分泌；TB病人在NK细胞和B细胞比例分别为0.42%和0.14%，NK细胞分泌，B细胞少许分泌。3.HD组中全血检测到分泌IL-9的各T细胞亚群比例与PBMC比较，HD组全血与PBMC在CD3中比例分别为0.35%和0.26%,在CD4中比例分别为0.22%和0.23%，在CD8中比例分别为0.32%和0.35%，在γδT中比例分别为1.07%和0.44%，γδT细胞在全血的比例高于PBMC,其它无明显差异。TB组中也是如此，全血与PBMC在CD3中比例分别为0.32%和0.34%，在CD4中比例分别为0.21%和0.29%，在CD8中比例分别为0.35%和0.56%，在γδT中比例分别为2.93%和1.84%，γδT细胞在全血的比例高于PBMC,其它无明显差异。4.用Mtb-HAg再刺激Mtb-AT检测IFN-γ和IL-9的分泌，HD和TB组中，产IFN-γ的γδT比例（TB=15.84%，HD=4.50%）均明显高于单加Mo的未刺激组（TB=0.99%，HD=0.89%），P0.05,而分泌IL-9的γδT细胞的比例与单加Mo的未刺激组没有差异。5.RT-PCR检测TB组和HD组的IL-9的mRNA表达，TB组高于HD组，P0.05。6.ELISA法检测IL-9在TB和HD全血上清的含量分别为7.13pg/ml（n=30）和5.14pg/ml（n=30）,在TB中含量明显高于HD,P0.05。结论:1、用流式细胞术检测胞内细胞因子的方法证明，IL-9产生细胞不仅存在于CD4T细胞亚群中，在CD8T细胞,???T细胞以及非T细胞中也有一定比例。2、TB病人外周血中产生I