肝细胞生长因子的克隆 表达以及体内外的应用-cloning and expression of hepatocyte growth factor and its application in vitro and in vivo.docxVIP

中文摘要目的：本研究建立了一种非病毒型人肝细胞生长因子（Human hepatocyte growth factor, HGF）的基因治疗方式，避免病毒载体基因治疗所导致的副作用[1]。 通过定性及定量检测体外培养的人成纤维细胞中 HGF 的表达及其体内应用，为 HGF 治疗脱发、促进毛发再生的临床应用提供一个前景良好的实验依据。方法： 克隆人的 hHGF 全长 cDNA 片段，插入 pTARGET 真核表达载体中，得到 pTARGET-HGF 质粒。采用脂质体 lipofectamin2000 包裹重组质粒将其转染到体 外培养的人的皮肤成纤维细胞中（Human skin fibroblasts,HSF）。由于本研究室之 前已经构建成功的 pEGFP-N1-HGF 含有报告基因绿色荧光蛋白（GFP），在荧光 显微镜下观察转染率具有直观性，所以在探索最佳细胞接种密度、DNA 浓度和 脂质体浓度等因素时，用 pEGFP-N1-HGF 得到的最佳转染率作为参考。采用蛋 白质印记方法（western blot）、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）分别进行 HGF 蛋白表达的定性定量检测后，将其通过皮下注射应 用于小鼠体内，通过 HE 染色、免疫组化（Immunofluorescence staining）检测 HGF 在小鼠皮肤内的表达。结果：1. 质粒构建成功后，双酶切结果：经去内毒 素提取纯化质粒后，BamHI、SalI 进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后，可 得到 5.67kb 和 2.2kb 两个片段，与 pTARGET 质粒的图谱相符，证明所得到的质 粒为重组子 pTARGET-HGF。2.经传代培养的成纤维细胞在达到对数期的良好生 长状态，既 80% 的 细 胞 达 到 融 合 后 ， 转 染 目 的 质 粒 pTARGET-HGF 、 pEGFP-N1-HGF，在荧光显微镜下观测到经 pEGFP-N1-HGF 质粒转染后的细胞 发出绿色荧光，得到细胞接种密度为 3.0×105，DNA 浓度为 0.8μg，脂质体用量 为 4.5 μL 时获得最高转染率，分别为 57.35 ± 1.29%、 52.47 ± 1.26% 和 57.73±1.31%。3. 体外转染细胞后，采用 western blot 证明重组的 pTARGET-HGF 基因在成纤维细胞中有所表达，同时提取转染后的细胞上清液，经 ELISA 鉴定 后检测到 hHGF 在转染到人的皮肤成纤维细胞后可以分泌出 hHGF，其分泌量达 到（5.76 ~ 10.74 ng/ 9×105 cells）。将其用于体内后，发现实验组与对照组相比， 毛囊生长明显浓密，且经免疫组化检测到 HGF 在皮肤中的表达。结论：成功构建含有 HGF 基因的真核载体 pTARGET-HGF，并将其应用于 体外试验中，检测到其表达及分泌后，再将其用于体内，发现小鼠的毛囊发育有 明显的改善。由此可证明 HGF 具有生发的作用。关键词：肝细胞生长因子； 转染；成纤维细胞；动物模型ABSTRACTObjective: The aim of this study is to establish nonviral gene therapy of Human hepatocyte growth factor (hHGF) avoiding the viral vector-related side effects[1]. By detecting HGF expression in quality and quantity in human fibroblasts cutured in vitro and the application in vivo, our study provide an promising strategy for treating alopecia areata and promoting hair regeneration in clinical therapy. Methods: The whole sequence of hHGF cDNA was cloned, conserted in the eukaryotic vector of pTARGET plasmid, then the recombinant of pTARGET-HGF was constructed. WithLipofectamine 2000, the pTARGET-HGF plasmid was transfected into human skin fibroblasts(HSF) cul