肝再生增强因子特异性结合短肽的筛选和抗肝癌的实验分析-screening of short peptides specifically binding to liver regeneration enhancer and experimental analysis of anti-liver cancer.docx

参考文献 68第四章 hALR 特异结合肽的免疫原性和对重要脏器的毒性研究 69前言 691 材料 692 方法 703 结果 724 讨论 74参考文献 75全文小结 76不足与展望 77附 图 78 文献综述：噬菌体展示技术及其应用 87 致 谢 102 攻读博士学位期间发表的论文 103英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称ALRAugmenter of liver regeneration肝再生增强因子bpBase pair碱基对BSABovine serum albumin牛血清白蛋白 cDNAComplementary deoxynucleic acid互补脱氧核糖核酸 DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺Dulbecco 改良的 Eagle 培DMEMDulbeccos modified Eagles medium养基DMSODimethyl sulfoxide二甲基亚砜ELISAEnzymelinked immunoassay酶联免疫吸附实验FBSFetal bovine serum胎牛血清HumanaugmenterofliverhALRregeneration人肝再生增强因子HEHematoxylin and Eosin苏木精-伊红染色异丙基-硫代-β-D 半乳糖IPTGIsopropyl-1-thio-β-D-galactoside苷kDKilodalton千道尔顿LBLuria-bertain mediumLB 培养基minMinute分钟mRNAMessenger ribonucleic acid信使核糖核酸ODOptical density光密度PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPolymerase chain reaction聚合酶链反应PEGpolyethylene glycol聚乙二醇pfuPlaque forming units噬菌斑形成单位rpmRevolution per minute每分钟转速SDSSodium docecylsulphate十二烷基磺酸钠1siRNASmall interfering RNA小干扰 RNATBSTris buffered salineTris 盐缓冲液Trisbufferedsalinewith0.05%TBSTXgalTween-205-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D galactosideTris 盐吐温缓冲液5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 乳 糖苷2肝再生增强因子特异性结合短肽 的筛选和抗肝癌的实验研究1摘要目的：人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration， hALR）是肝脏修复与再生过程中的一个重要的调控因子。hALR 在多 种组织中有表达，特别在肝癌组织中表达增强。hALR 能以自分泌形式 促进肝癌细胞增殖，anti-hALR 单抗和 siRNA 能阻断 hALR 对肝癌细胞 的促增殖的作用。但 siRNA 需要导入到活体肝细胞中才能发挥作用， 而异源性单抗具有其免疫原性，应用时可能引起过敏反应，反复使用 会使机体产生相应的抗体，抵抗其作用。因此 siRNA 和单抗的应用具 有局限性。目前 hALR 的受体并不明确，使得针对其受体的药物不能 发挥阻断 hALR 与之结合的作用。所以，我们拟从噬菌体肽库中筛选 到能与 hALR 特异结合的短肽，并对其进行测序、合成和生物学功能 的初步研究，以期能筛选到可以阻断 hALR 促肝癌细胞增殖活性的短 肽，为肝癌的治疗提供新的短肽药物。方法：1． hALR 的表达、纯化及活性鉴定：hALR 在毕赤酵母中表达，经超滤纯化后，加入 HepG2 细胞和 QGY细胞中，观察 hALR 对肝癌细胞增殖的影响。基金资助：国家自然科学基金 项目编号：3097133432． hALR 结合肽的筛选：以 hALR 作为靶分子，从噬菌体十二肽库和噬菌体七肽库中筛选 能与 hALR 特异结合的噬菌体克隆；对捕获的特异结合噬菌体进行插 入肽序列 PCR 扩增和 ELISA 鉴定；同时对 PCR 产物进行测序并进行 插入肽序列比对；合成与 hALR 特异结合的十二肽及其对照肽。3． hALR 特异结合肽对肝癌细胞增殖的影响：（1） 用 MTS 方法检测 hALR 特异结合肽阻断 hALR 后对人肝癌 细胞株 HepG2 和 QGY 增殖活性的影响：以 1:100 的抗 hALR 单抗作为阳性对照，不加任何处理因素的细胞 作为阴性对照，分别以终浓度为 5ug/ml，10ug/ml，20ug/ml，40ug/ml 的 hALR 特异结