干扰及过表达mir-31对脊髓源神经干细胞分化的影响-effects of interference and overexpression of mir - 31 on differentiation of spinal cord-derived neural stem cells.docxVIP

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果............................................................................ 44个人简历 .............................................................................................................................................. 45干扰及过表达 miR-31 对脊髓源神经干细胞分化的影响摘要目的:1. 使用 Alexa FluorR Red 检测 RNAiMAX 对神经干细胞的转染效率，确定最终 的转染效率最高的时间。2.观察 miR-31 对神经干细胞向运动神经元分化时所起作用，研究 miR-31 和神经 干细胞之间的相互关系。方法:第一部分：RNAiMAX 对神经干细胞的影响及转染效率的测定 首先从胎鼠体内获得脊髓源神经干细胞，体外分离培养并鉴定。当干细胞传至 3代后，接种于铺设多聚赖氨酸处理过盖玻片的六孔板中，分为不加 RNAiMAX 组和 加 RNAiMAX 两组，通过 0d、1d、2d 和 3d 的连续观察，研究 RNAiMAX 对神经干 细胞的影响作用。并继续将细胞分为 1d、2d 和 3d 三组，转染 Alexa FluorR Red 观察 RNAiMAX 对神经干细胞的转染效率。当达到相应的时间点时，取出细胞并用多聚甲 醛固定，之后将细胞位于荧光显微镜下观察，计算发出红色荧光细胞和总细胞数之比 确定 RNAiMAX 对神经干细胞的转染效率。第二部分：miR-31 对神经干细胞的诱导作用 将细胞分为干扰组、干扰对照组、过表达组、过表达对照组和对照组，转染相应试剂后观察细胞的形态学变化，并通过 ChAT 的免疫细胞化学染色观察胆碱能神经元 的分化情况。提取 RNA 后检测 miR-31 的诱导是否成功，并反转录为 cDNA 后通过 荧光定量 PCR 检测下游基因在 miR-31 的表达变化后的变化情况。通过以上分析 miR-31 在神经干细胞干性维持方面的作用。结果：第一部分：当 RNAiMAX 加入到神经干细胞后，细胞开始死亡。通过在时间节 点镜下观察可知，在第一天时转染效率是 20%-30%，第二天时转染效率是 40%-55%，I当达到第三天时，转染效率为 60%-75%。说明 Alexa FluorR Red 会随着时间的推移增加转染的细胞数，提高细胞的转染效率。第二部分：转染 miR-31 的 mimic 和 inhibitor 后，细胞的形态和分子层面都发生 了变化。形态学方面可以看出，转染 miR-31 的抑制剂后，细胞的形态更接近于运动 神经元，细胞呈长梭形，在免疫细胞化学染色中可以看出 ChAT 的表达升高，细胞荧 光呈强阳性；而在转染 miR-31 过表达试剂后，细胞贴壁后形态变化不明显，突起伸 出不多，ChAT 的表达明显降低，荧光强度明显弱于抑制组。microRNA 的反转录产 物荧光定量 PCR 结果显示干扰组的表达为 0.867，干扰对照组的表达为 2.406，过表 达组为 1.022×106，过表达对照组为 1.506×105，说明细胞转染成功。而下游基因也有 明显变化。在干扰组中表达明显升高的有 hb9 和 stmn1，表达降低的有 Nestin、lats2、 Rhobtb 和 SATB2。过表达组明显升高的有 Nestin、hb9、lats2 和 SATB2，表达降低 的基因有 Rhobtb。结论：1.RNAiMAX 对神经干性毒性较大，会造成大量的细胞死亡，在实验时需加大细 胞的用量。通过转染效率的测定，RNAiMAX 在第三天的转染效率最高。2.miR-31 高表达对神经干细胞有很好的干性维持作用，抑制时神经干细胞向运动 神经元的分化增加。关键词：脊髓损伤；神经干细胞；microRNA；转染，RNAiMAX The effects of up-regulation and down-regulation of miR-31 to the spinal cord derived neural stem cellAbstractObjective：Transfection efficiency using Alexa FluorR Red to detect RNAiMAX on neural stem cells, determined finally the highest transfection efficiency of time.To observe the effect of miR-31 on neural