干细胞转rad-hcn4 治疗缓慢心律失常的研究-study on the treatment of bradyarrhythmia by stem cells transforming rad - hcn 4.docx

The Study of Transfection of Rat Bone Marrow Mesenchymal Stemcells with Recombinant Adenovirus Vector Containing Human HCN4 Gene for BradyarrhythmiaＡ Dissertation Submitted to Xinjiang Medical UniversityIn Partial Fullfillment of the Requirements for the Degree ofDoctor of MedicineBy WANG HUANInternal MedicnieDissertation Supervisor: ( Pro.Hou Yue-mei )March,2016论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 了谢意。学位论文作者签名：签字日期： 导师签名：签字日期： 关于论文使用授权的说明本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定， （选择“同意/不同意”）以下事项：1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘 版)电子杂志社”用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》或其他同类 数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：签字日期： 导师签名：签字日期： 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名5-aza5-azacytidine5-氮胞苷BMSCbone marrow stem cells骨髓间充质干细胞CX43connexin43缝隙连接蛋白 43EFejection fraction射血分数GFRgreen fluorescent protein绿色荧光蛋白HCN4hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 4人类超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型 4HEK293human embryonic kidney cells人胚胎肾细胞rAdrecombinant adenovirus重组腺病毒SSSsick sinus syndrome病态窦房结综合征目录摘要 1Abstract3前言 5第一部分构建重组人 HCN4 基因腺病毒载体和扩增纯化111研究内容与方法 111.1研究对象 111.2内容与方法 121.3质量控制 131.4统计方法 141.5技术路线图 142结果 143讨论 184小结 28第二部分5-氮胞苷诱导后的大鼠骨髓间充质干细胞转 HCN4 基因291研究内容与方法 301.1研究对象 301.2内容与方法 301.3质量控制 311.4统计方法 321.5技术路线图 322结果 323讨论 364小结 48第三部分HCN4 生物起搏器植入动物模型有效性和安全性的评估 491研究内容与方法 501.1研究对象 501.2内容与方法 501.3质量控制 521.4统计方法 521.5技术路线图 522结果 523讨论 564小结 72结论 73致谢 74参考文献 75综述 91攻读博士学位期间获得的学术成果 102个人简历 103导师评阅表 104摘要干细胞转 rAd-HCN4 治疗缓慢心律失常的研究研究生：王欢导师侯月梅教授/主任医师马依彤教授/主任医师摘要目的：1）构建携带人超极化激活环核苷酸门控阳离子通道 4（HCN4）基因的 重组腺病毒载体，获得重组腺病毒 rAd-HCN4，为进一步在细胞和动物水平研究 HCN4 基因的功能奠定基础。2）通过以不同浓度 5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞， 观察诱导后细胞形态、有无自主搏动及 Westernblot 检测 Connexin43 结果，为构建 生物起搏器提供有效载体细胞。3）本研究通过刺激迷走神经建立缓慢心律失常模型， 对比 rAd-HCN4-GFP 诱导后干细胞及 rAd-GFP 诱导后干细胞植入动物后心率、心功 能、肝肾功能、Connexin43 含量的对比，从而获得有效性及安全性的证据，为临床 提供一定的参考价值。方法：1）根据细菌内同源重组的方法使用 AdEasy 腺病毒包 装系统，将人 HCN4 基因克隆到腺病毒穿梭载体质粒 pshutt