仪器分析课件07-3-液相色谱法教程文件.pptVIP

各种液相色谱法的比较 HPLC条件和类型的选择 影响HPLC分离效果的因素 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。 影响HPLC分离效果的因素 流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 分离类型的选择 1．根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。 2．根据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水井属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 3．根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。 HPLC分离类型选择 HPLC——分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 HPLC——检测器Detector 理想的HPLC检测器要求 灵敏度高 对所有的溶质都有快速响应 响应对流动相流量和温度变化不敏感 不引起柱外谱带扩展 线性范围宽 使用范围广 至今没有一种检测器能够类似于GC中的TCD和FID，做到以上的这些要求。 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 HPLC——检测器Detector HPLC——UV detector 紫外（可见）吸收检测器：UVD 应用最广（70%） 需要组分对紫外光（可见光）有吸收 固定波长，可调波长，光电二极管阵列三类 特点： 灵敏度高；线形范围高； 流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 HPLC——Fluorescence Detector 荧光检测器（FD） 选择性浓度型 高灵敏度，高选择性 对象 发射荧光的物质 利用荧光试剂修饰的物质 比UVD检测灵敏度高2-3个数量级，达到10-12~10-13g/cm3 可以梯度淋洗 一般用于检测多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等 HPLC——示差折光检测器 differential refractive index detector 通过连续检测参比池和测量池中溶液的折射率（refractive index）的差别来测定浓度的。 通用型检测器 检测的化合物范围广 检测灵敏度在10-7g/cm3 缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗 有反射、偏转和干涉三种类型 HPLC——其他检测器 电导检测器 选择性检测器 在离子色谱仪中应用最多 缺点是受温度影响大，而且在pH7时不灵敏 蒸发激光散射检测器 根据不蒸发的溶质微小颗粒对激光的散射来检测 只跟溶质颗粒的大小和数量有关，与溶质的化学组成无光 不能鉴别化学成分 HPLC中的固定相和流动相 stationary phase and mobile