卡拉胶降解酶分离纯化.docVIP

1.前言 卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。卡拉胶是由，1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。与琼胶相比，卡拉胶所有的β-连接和α（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在α（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。对卡拉胶来说，它的结构在α（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图[1] 卡拉胶可分为八种类型。κ-卡拉胶，τ-卡拉胶，λ-卡拉胶，γ-卡拉胶，υ-卡拉胶，φ-卡拉胶，ξ-卡拉胶，ω-卡拉胶。另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为β-族卡拉胶、κ-族卡拉胶、λ-族卡拉胶。 卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶[2]。 而卡拉胶酶主要有κ-卡拉胶酶，τ-卡拉胶酶，λ-卡拉胶酶等，其主要是依据所降解的底物命名的。许多海洋微生物如Pseudoalteromonas carrageenovora,Pseudomonas carrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）[5]。 根据作用机制卡拉胶降解酶分为保持型和转换型两种。1995年，Philippe Potin等人报道交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的κ-卡拉胶降解酶，预测其分子量为44,212 Da，远大于经SDS测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的分子量35 kDa。cgkA基因编码的κ-卡拉胶降解酶序列与GH16家族中其他成员的序列具有较高的相似度，GH16家族水解酶催化区域多序列分布表明κ-卡拉胶降解酶的Glu163残基在催化过程中起作用。免疫印迹实验表明天然和重组的细菌胞内提取物都存在一个分子量为44±2 kDa的蛋白分子，表明κ-卡拉胶降解酶以前体蛋白形式产生并在分泌过程中经历了两次蛋白水解切割作用，即先切去信号肽，然后再切去C末端区域从302位点到397位点的96个氨基酸。成熟的κ-卡拉胶降解酶由275个氨基酸组成。为了评定分子机制，通过使用凝胶过滤色谱和13C-NMR技术分析κ-卡拉胶降解酶水解新卡拉六醇的产物，结果显示最先形成新卡拉二醇和β-新卡拉四糖，说明酶作用的分子机制为保持异构体构型。2001年，Gurvan Michel等人[6]在研究P. carrageenovora所产κ-卡拉胶降解酶的活性部位时，首次提出隧道模型，认为酶的隧道状活性部位与多糖的降解有关。其中谷氨酸残基E163E168分别起亲核催化作用和酸碱催化作用，天冬氨酸残基D165在催化循环中促进最终转变状态解体。2003年，Gurvan Michel等人[7]在研究ι-卡拉胶的降解机制中通过用Alteromonas fortis 的ι-卡拉胶降解酶与ι-卡拉胶相互作用，发现碱性蛋白残基和多糖链的硫酸基之间的相互静电作用在识别ι-卡拉胶的过程中起主导作用。C末端的A结构域在天然酶中具有高度的灵活性，采用a/β的折叠形式。在底物与酶的复合体中，多聚阴离子模块向β螺旋凹槽移动，形成一个隧道在降解过程中酶从开放形式转变成闭合形式。ι-卡拉胶降解酶的催化腔仅能容纳一条ι-卡拉胶链，因此酶必须先把ι-卡拉胶双螺旋从ι-卡拉胶纤维结构中分离出来，然后再水解其中单一的ι-卡拉胶链。多聚阴离子的ι-卡拉胶链与卡拉胶降解酶的多聚阳离子的非催化表面相互作用，很可能取代了双螺旋之间的钙离子。非催化的外表面被看做一个楔子，可使双螺旋链与卡拉胶纤维分开，但其机理还未有明确的解释。ι-卡拉胶降解酶的隧道型活性部位在打开ι-卡拉胶双螺旋和阻止已分离的ι-卡拉胶链重新结合到晶体上的过程中起要作用。2007年，Guibet等人[8]对P.carrageenovora所产的λ-卡拉胶降解酶进行了纯化、克隆和测序序列分析表明，这一分子量为105 kDa的酶蛋白分子具有特征性区域，为一连接物连接至少两个独立的单元，N末端区域可能折叠为β-螺旋桨结构。通过1H-NMR和LC-MALLS技术检测λ-卡拉胶的酶解过程表明λ-卡拉胶酶为内切酶，并通过异构体构型完全转换的分子机制来解λ-卡拉胶。[9]。 2 材料 2.1 菌种 Cellulophaga lytica strain:N5-2 2.