sema-3a对树突状细胞b7-h4表达的影响-effect of sema - 3a on b7 - h4 expression in dendritic cells.docxVIP

正文引言树突状细胞（Dendriticcells，DC），因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名，是目前已知的专职的功能最强的抗原提呈细胞，是移植免疫、自身免疫性疾病、炎症反应及肿瘤治疗研究的热点。B7-H4又称B7S1和B7x，于2003年被发现，是最新加入B7家族的又一成员。B7-H4表达在专职抗原提呈细胞（APC）上，受白细胞介素10(IL-10)的诱导[1]，并广泛分布在非淋巴组织中。研究证实多种Semas分子介导DCs的免疫应答，参与对其生物活性和免疫功能的调节[2]。Sema-3a影响DC功能的机制尚不明确，本研究通过研究Sema-3a-Ab对DC表面B7-H4表达的影响，探讨Sema3a影响DC功能的可能机制。材料与方法1.1.1主要试剂RMPI1640全培养液含RMPI1640培养基（Gibco公司）、10％新生牛血清（FetalCalfSerum，FCS，Gibco公司）、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素及5×10-5M2-巯基乙醇(Amerco公司)。红细胞裂解液由本室配制。重组小鼠细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Recombinantmicegran-ulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，rmGM-CSF，RD公司）及重组小鼠白细胞介素4(Recombinantmiceinterleukin-4，rmIL-4，RD公司)，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，Sigma公司）。流式单克隆抗小鼠CD11c（PE-anti-mouse-CD11c-antibody,abcam公司）。B7-H4（PE-anti-mouse-B7-H4-antidody,ebioscience公司）。1.1.2实验动物雄性BALB/c(H-2d)小鼠,6～10周龄，体重20～25g，由华中科技大学同济医学院器官移植研究所提供。本试验对小鼠的处置符合国家相关法律法规的要求，得到华中科技大学同济医院的实验动物伦理委员会的许可。1.1.3主要仪器流式细胞仪（FACS-Aria，美国BeetonDickson公司），倒置显微镜（Olympus公司）。Thermo恒温培养箱（FormaSeriesII，HEPACLASS100）。1.2方法1.2.1小鼠骨髓源性DCs的培养颈椎脱位法处死BALB／c小鼠，无菌分离股骨并以不含有血清的培养基冲洗出骨髓细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞，碎片和残留肌肉组织，以含10％FCS、rmGM—CSF（10ng／ml）和rmlL-4（1ng／ml）的RPMI1640完全培养基(DCs培养基)培养。3天后，换新鲜培养基。其中的一半于第五天加入脂多糖（1ug/ml），以制备成熟的DC。继续培养3-4天后，收集悬浮及疏松贴壁的细胞聚集体备用。1.2.2DC细胞鉴定采用流式细胞直接免疫荧光标记法对所得细胞进行鉴定。收集上述细胞，调整每管细胞数为3*105，按说明书分别加入CD11c的荧光单抗（PE-标记）染色。用流式细胞仪检测，CellQuest软件计算阳性细胞的比率。1.2.3DC细胞的分选采用流式细胞直接免疫荧光标记法对所得细胞进行分选。收集上述细胞，调整每管细胞浓度为3*106/ml，按说明书分别加入CD11c的荧光单抗（PE-标记）染色。用流式细胞仪分选CD11c+DC。1.2.4Sema-3a-Ab体外干预将成熟（mDC）、非成熟（imDC）细胞分别均匀接种于24孔培养板，每孔细胞数为3*105，总量为1ml。分为Sema-3a-Ab（按加入的抗体浓度分三组，如下述）和对照组，共8组，每组设3个复孔。对照组加入培养基作为空白对照；实验组加入Sema-3a-Ab（抗体浓度分别为1：500，1：1000，1：2000），于37℃，5％C02条件下培养72小时后收集细胞检测。1.2.5DC表面B7-H4的测定采用流式细胞直接免疫荧光标记法检测检测CD11c，B7H4的表达。在加入Sema-3a-Ab72h后收集细胞，按说明书分别加入CD11c，B7H4荧光单抗染色。用流式细胞仪检测，CellQuest软件计算阳性细胞的比率。1.2.6统计学分析所有数据用均数±标准差（x±s）表示，用SPSSV17.0对各组数据之间进行比较，组间比较采用t检验，P≤0.05为差异具有统计学意义。结果结果2.1DC细胞的鉴定骨髓细胞在体外用不同的细胞因子可扩增出具有髓系特征的DC，CD11C+，CD11bdull，CD8+[3]。CD11c在DC细胞上特异性表达，所以CD11c+的细胞即为DC。用流式细胞仪检测所收集的细胞，CD11c+细胞达82.18%（见图1，图2）。图1图2图1使用流式细胞仪分析细胞时进行设门，选取要分析的细胞群。图1中R1所示即为选