sabin1分离株vp1基因准种进化研究及rflp法鉴定pv型别局限性探讨-study on quasi-species evolution of vp1 gene of sabin 1 isolate and discussion on limitations of rflp method in identifying pv type.docxVIP

缩略词表英文缩写PVSabin-1 MhGDL-1 CPEOPV RD RNA DMEMRFLPPBS PCRRT-PCR cDNAbp rpm hd min s英文全称poliovirusoral Poliomyelitis Vaccine sabin-1 mycoplasma hyorhinis GDL-1 cytopathic effectoral Poliomyelitis Vaccinehuman rhabdomyosarcoma cell line ribonucleic aciddulbecco’sModifiedEagles Mediumrestrictionfragmentlength polymorphism assayphosphate-buffered saline polymerase chain reaction reverse transcription PCR complementary DNA base pairrevolution per minute hourday minute second中文全称脊髓灰质炎病毒 沙宾 1 型猪鼻支原体 GDL-1 细胞病变效应 脊髓灰质炎病毒疫苗 人横纹肌肉瘤细胞系 核糖核酸改良 Eagles 培养液限制性片段长度多态 性分析 磷酸缓冲盐溶液 聚合酶链式反应 逆转录 PCR互补 DNA 碱基对每分钟转数 小时天 分钟 秒- 1 -Sabin-1 分离株 VP1 基因准种进化分析及 RFLP 法鉴定PV 型别局限性探讨中文摘要目的（1）分析从临床诊断为手足口病（hand, foot and mouth disease，HFMD） 的患儿咽拭子标本中分离的脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗株（oral poliomyelitis vaccine，OPV）的基因型别以及 VP1 基因的变异，探讨 OPV 分离株准种在体内外 的遗传进化方向。（2）从分子水平分析猪鼻支原体 GDL-1（Mycoplasma hyorhinis GDL-1，Mh GDL-1）对用限制性片段长度多态性（Restricted fragment length polymorphisms，RFLP）方法鉴定脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）型别的干扰。 方法 本研究由四部分内容组成：（1）HFMD 患儿咽拭子标本中的病毒分离与鉴定： 首先将采自临床诊断为 HFMD 的患儿的 133 份咽拭子标本分别接种 RD 细胞和 HEp-2 细胞进行病毒培养；阳性的培养物经反复冻融后进行低速离心、取上清超滤浓缩 后，提取病毒 RNA。用肠道病毒 71 型（enterovirus type 71，EV71）特异性引 物和柯萨奇病毒 A 组 16 型（Coxsakie A16，CA16）特异性引物进行 Real-time RT-PCR 检测；对非 EV71 非 CA16 的标本使用肠道病毒通用引物经 RT-PCR 扩增病 毒的 VP4 基因片断鉴定。（2）采用 PCR-RFLP 法对肠道病毒通用引物 RT-PCR 扩增 VP4 基因鉴定的两株 Sabin-1 分离株进行具体的型别鉴定，随后分别对两株 Sabin-1 分离株以及糖丸疫苗中 Sabin-1 VP1 全长基因进行扩增和测序。（3）RFLP 法鉴定 OPV 型别过程中，对未被核酸限制性内切酶切开的基因片段纯化回收后， 连接 T 载体并挑取单克隆进行测序。（4）通过测序序列与 GenBank 中 Sabin-1 标 准序列的比较，初步确定体内外 sabin-1 分离株准种的进化方向，然后通过分析 RFLP 法鉴定 PV 型别过程中未被限制性内切酶酶切片段测序序列，找到 PCR 产物 未被限制性内切酶酶切的原因。结果（1）采用 RFLP 法对两株 Sabin-1 鉴定过程中，PCR 扩增的基因片段在限制性内切酶酶切后电泳结果均呈现非典型的模式，其中 FY11039 Sabin-1 分离株的HpaⅡ单酶切电泳结果存在未被酶切的条带，而 FY12110 Sabin-1 分离株 HaeⅢ、 DdeⅠ、HpaⅡ单酶切电泳结果中均未被酶切的条带。（2）分别纯化回收未被酶切 的电泳条带后，经 T 载体克隆测序，发现 FY11039 分离株 VP1 基因序列上第 126 位碱基由 G 突变成 A，而导致 VP1 基因 480bp 片段无法被酶切。而 FY12110 分离 株 HaeⅢ、DdeⅠ、HpaⅡ的单酶切失败的条带，测序结果为猪鼻支原体 GDL-1 （P3 蛋白）基因序列。（4）随机挑取的 19 个不同的 FY11039 分离株 VP1 基因全长克隆 序列分析结果显示，出现 VP1 基因第 126 位碱基由 G→A 的共有 7 个不完全相同的 克隆序列，