新型隐球菌fq-pcr检测体系在血流感染动物模型的应用研究-application of fq - pcr detection system for cryptococcus neoformans in animal model of blood flow infection.docxVIP

前言.........................................................................................................9材料与方法...........................................................................................11结果.......................................................................................................15附图.......................................................................................................18附表.......................................................................................................24讨论.......................................................................................................25结论.......................................................................................................28参考文献...............................................................................................28综述FQ-PCR检测技术在新型隐球菌发病及临床检测的研究进展37致谢...............................................................................................................47个人简历.......................................................................................................48新型隐球菌FQ-PCR检测体系在血流感染动物模型的应用研究摘要目的：建立新型隐球菌血流感染动物模型，收集动物血浆和肺泡灌洗液标本，同时进行FQ-PCR、培养、墨汁染色、组织病理、乳胶凝集实验对照观察，探讨FQ-PCR检测体系在动物模型标本中DNA的诊断价值及与所选的四种比较方法的优选性，奠定临床真菌PCR检测试剂盒开发的基础，以实现真菌感染的早期临床诊治，降低临床真菌感染的病死率及治疗成本。方法：1实验研究方案：（1）标准株培养及制备，标准新型隐球菌接种于PDA平板37℃培养48小时后，用接种环刮取菌落溶于生理盐水放入已消毒的EP管中；通过血细胞计数板计数，制成细胞浓度约为106CFU/ml的混悬液，作为标准株储存液，置于-80℃冰箱备用。（2）动物模型，32只雄性SD大鼠，采用随机分配原则分为4组，同时称重，编号，分别笼养，按时提供食物和水。A组：免疫抑制感染组（n=10只）:注射环磷酰胺（150mg/kg）溶液进行免疫抑制大鼠，尾静脉注射新型隐球菌菌悬液感染动物；B组:正常状态感染组（n=10）,注射等量的生理盐水，模型建立后尾静脉注射新型隐球菌菌悬液感染动物C组:正常对照组（n=6）:正常饲养；D组免疫抑制对照组（n=6）；仅注射环磷酰胺（150mg/kg）溶液进行免疫抑制大鼠。A+B为实验组（感染后第3天全部处死），C+D为对照组（感染后第3天全部处死）。2统计学方法：全文在数据处理和分析中均采用SPSS20.0统计软件进行统计学处理，将采集的实验组和对照组动物的血清和支气管肺泡灌洗液标本FQ-PCR检测后结果进行比较。实验组不同天数与对照组先进行总体的χ2检验，当P0.05，实验组与对照组差异有统计学意义。各实验组不同时间点与同一对照组进行两两比较，检验水准要调整为a--0.05/2(5.1)，即当P0.00625时，差异有统计学意义。结果：1免疫抑制感染组感染后24小时出现开始出现食欲差，活动减少，被毛失去光泽，鼠毛蓬乱，前足抱头身体呈弓形逐；正常状态感染组仅见3例食欲减低，活动少，对照组一般情况良好；2感染后第3天处死大鼠，取肺组织和其它脏器（肝、脾、脑）。实