新型荧光探针检测平台的构建及其在mirna-21和udg检测中的应用-construction of a new fluorescence probe detection platform and its application in mirna - 21 and udg detection.docxVIP

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2018-06-03 发布于上海
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新型荧光探针检测平台的构建及其在mirna-21和udg检测中的应用-construction of a new fluorescence probe detection platform and its application in mirna - 21 and udg detection

摘要近年来，荧光分子探针技术基于灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，已经广泛应用于化学、医学和生物学等领域。本论文通过设计和合成多种靶向性新型分子信标，在对其性能进行研究的基础上，将其应用到复杂生物样品中的靶分子定量检测、分析，结合经典分子生物学研究手段进一步探讨分子信标在临床生物大分子检测和诊断中的潜在应用价值。本文的主要研究内容如下：1.分子信标用于肿瘤相关的miRNA-21表达水平的快速、简单检测本章以根据miRNA-21序列组成设计合成可特异性识别miRNA-21的分子信标为工具，发展了一种基于分子信标直接在总RNA中检测miRNA-21的方法。在利用荧光波长扫描技术考察了分子信标的热稳定性、杂交性能和特异性以及信标与靶分子杂交条件优化的基础上，将该技术直接用于培养的肿瘤细胞和人胃癌组织中的miRNA-21表达水平检测。结果发现：具有良好的杂交性能和特异性的分子信标检测标准样品的下限可达到0.5nM，能够快速实现肿瘤细胞和组织中的miRNA表达水平差异性检测，结果表明：在17例标本胃癌组织中有10例(59%)miRNA-21表达水平高于癌旁组织；检测结果的可靠性进一步通过qRT-PCR进行验证；此外，采用Westernblotting对miRNA-21直接调控的目的基因PDCD4和PTEN表达水平进行检测，发现其蛋白表达与miRNA-21表达趋势呈负相关。2.基于分子信标结合酶促信号放大用于miRNA-21的超灵敏检测本章目的是利用设计和合成茎部为RNA的新型嵌合分子信标建立一种基于双重信号放大系统超灵敏检测miRNA的新方法。在通过荧光法考察该分子信标的稳定性、抗酶切能力以及杂交条件的基础上，以体外合成的标准miRNA-21为检测对象，发现这种具有双重信号放大功能的分子信标检测技术检测下限可以达到1pM，其灵敏度比纯粹的分子信标检测法高3个数量级。进一步用于胃癌组织样品检测结果表明：该方法可用于准确检测0.2μg总RNA中的miRNA-21表达水平。3.基于分子信标实时监测UDG酶活性方法的建立及其应用本章以含有损伤碱基尿嘧啶的嵌合型分子信标作为酶促底物和信号报告分子，建立一种UDG酶的分析方法。通过实时荧光的方法来进行UDG酶的活性分析和对UDG酶的热动力学进行考察。结果表明UDG的检测下限可以达到0.005U/ml，UDG酶的KM和kcat值分别为0.89±0.1μM和210±10min-1。接着将其用于UDG酶抑制剂的筛选，发现5-氟尿嘧啶和顺铂具有显著UDG酶活性的功能，其IC50分别为6.1±0.52mM和3.2±0.24mM。最后将该方法用于不同肝癌细胞系和血清样本中的UDG酶表达水平差异分析。关键词：分子信标；miRNA-21；UDG；肝癌；胃癌AbstractRecently,novelfluorescentprobetechnologyhasalreadypenetratedintomanyaspectsofchemistry,medicineandbiologyandotherfieldsbasedonitsadvantagesofhighsensitivity,specificityandsimpleoperation.Severalkindsoftargetedmolecularbeaconsinthispaperhavefirstlydesignedandsynthsised,thentheywereappliedforquantitativedetectionandanlysisoftargetmoleculesincludingmiRNA-21andUDGincomplecatedsamplesbaseontheirperformance.Othertraditionalmethodswereadoptedtofurtherconfirmthereliabilityoftheresultsgettingfromthesenewdevelopedfluorescencemethods.Maincontentsinthisdissertationareasfollows:EstablishmentofasimpleandrapidmethodformiRNA-21detectionintumorsamplesbasedonmolecularbeaconThepurposeofthischapteristodevelopanewmethodfordetectingmiRNA-21incomplicatedtumorsamplesbyusingtarget-specificmolecularbeacon.Thecharacteristicsofstability,meltingtemperatu