新型原位聚合酶链反应在检测肝组织中hbv cccdna的临床应用价值研究-study on the clinical application value of novel in-situ polymerase chain reaction in detecting hbv cccdna in liver tissue.docxVIP

新型原位聚合酶链反应检测肝组织中HBV cccDNA 的临床应用价值研究中 文 摘 要乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染是呈世界性流行， 据世界卫生组织统计，全球大概有 3.5 亿 HBV 携带者，其中约有 10％发展为慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B, CHB）进而发展为肝 硬化、肝衰竭以及原发性肝癌等严重的并发症，每年约有 28 万人死 于HBV感染相关性疾病[1]。HBV cccDNA 又 称 乙 型 肝 炎 病 毒 共 价 闭 合 环 状 DNA ，是 HBVDNA 复制的中间体，亦是 HBV 前基因 RNA 复制的模板，只有 彻底清除 HBV cccDNA, 才能真正清除乙肝病毒,因此 HBV cccDNA 的检测对研究乙型肝炎致病机制和评价抗病毒药物的疗效及新药的 研发等方面具有重要的意义。利用 PSAD（质粒安全 ATP 依赖 DNA 酶）消化、原位滚环扩增（RCA）等方法进行原位 PCR 检测肝组织 中的 HBV cccDNA 是目前来说较新的一种原位 PCR 方法，与液相 PCR 相比不需从肝组织中提取 DNA 只需在组织切片上即可进行原位 扩增，与 southern 相比，不需要电泳、转膜等一系列复杂的操作步骤， 与原位杂交相比，可以将低拷贝的 HBV cccDNA 通过扩增检测出来， 与传统的一步原位 PCR 方法相比较，由于经过 PSAD 消化处理去除 了非 cccDNA 的影响以及原位 RCA 只扩增 cccDNA，再加上特异性标记跨的缺口引物扩增，使敏感性和特异性均得到了提高，而且还可以在分子水平上将组织形态与基因定位、分布状态较好地联系起来， 还可进一步了解 HBVDNA 的复制能力，不但可以为临床抗病毒治疗 提供指导，而且为乙型肝炎的病理学研究提供了适宜的手段。 目的： 利用新型原位聚合酶链反应检测肝组织中的 HBV cccDNA， 明确 HBV cccDNA 在肝组织中的分布状况，为进一步研究 HBV cccDNA 在乙型肝炎的致病机制及探讨乙肝治疗的新途径提供分子病 理学基础。方法：1、 收集 30 例乙型肝炎、乙肝后肝硬化及肝癌患者的石蜡包埋组 织切片，采用同一石蜡包埋肝组织连续切片进行 HE 染色， 并对染色结果进行炎症活动度与肝纤维化程度分级分期，并 对每一个石蜡包埋的肝组织进行 HBsAg 和 HBcAg 免疫组织 化学染色.2、 将肝组织切片进行防脱及通透化处理后采用 PSAD 消化，为 证明 PSAD 的作用，我们将切片 PSAD 消化前后采取同一种 扩增方法的两张切片进行对比，通过对有无 PSAD 消化的两 种原位 PCR 对比，来突出本方法的优势，证明 PSAD 去除松 弛的环状 HBVDNA 及其他形式的 DNA，从而增加了检测的 特异性。3、 为进一步验证滚环扩增的效果，取两张同一肝组织连续切片 分别进行 PSAD 酶消化后采用半套式原位 PCR 检测和滚环扩增加上跨缺口的原位 PCR 检测，对两种方法的图像结果进行对比分析，评价两种方法的敏感性与特异性，从而判断新型 原位 PCR 方法的敏感性和特异性，探讨其应用价值。结果：1、30 例 HBV 感染患者组织切片病理学分级、分期为 G1-4S0-4， 诊断为慢性乙型肝炎 23 例、肝硬化患者 1 例，肝癌患者 6 例；免疫组化 HBsAg,阳性为 26 例，HBcAg,阳性为 18 例2、 应用新型原位 PCR 检测肝组织中 HBV cccDNA， 30 例组织 切片有 20 例为 HBV cccDNA 阳性，阳性检出率 67%，组织切 片阳性表达率为平均 35%-70% 。以核型为主，呈蓝色、紫色 或紫蓝色，呈颗粒状、弧形或圆形团块状，主要在核及核膜上 分布。3、 将切片 PSAD 消化前后采取同一种扩增方法的两张同一肝组 织切片进行对比发现使用 PSAD 消化的切片，扩增的 HBV cccDNA 阳性颗粒较明显，未使用 PSAD 消化的肝组织切片上 扩增的阳性颗粒不明显，说明 PSAD 去除了部分非 cccDNA 的干扰，使特异性和敏感性均得到了提高。4、 应用新型原位 PCR 检测肝组织中 HBV cccDNA 与同一连续切 片的半套式原位 PCR 方法相比，扩增的基因点较集中，颗粒 扩散范围较小，因此特异性更高。与传统的一步原位 PCR 相 比，新型原位 PCR 能检测到传统原位 PCR 检测不到的 HBV cccDNA 阳性颗粒，因此敏感性更强。5、阴性患者及阴性对照肝细胞胞核为红色,未见 HBVcccDNA 阳性颗粒。6、 总计 30 例检测患者中,6 例慢性乙型肝炎患者、1 例酒精性肝 硬化合并乙肝肝硬化静止期的患者、1 例肝癌和 1 例乙肝慢性 重