鸭nod1mapk1基因的克隆表达与荧光定量pcr检测方法的建立-cloning and expression of duck no d1 mapk 1 gene and establishment of fluorescence quantitative pcr detection method.docxVIP

摘要细胞因子在先天免疫中发挥着重要的作用，主要参与炎症反应和免疫应答，当机 体出现病变或受到外界刺激时，机体内某些细胞因子的转录水平和表达水平会发生明 显的变化。目前国内外关于哺乳动物细胞因子的研究较多，针对禽类细胞因子的基因 序列以及它们的蛋白功能研究较少。本研究克隆了鸭 MAPK1 和 NOD1 的基因序列， 并建立了实时荧光定量 PCR 方法检测其转录水平。在原核表达系统中表达了 MAPK1 重组蛋白并以此为基础，制备了其单克隆和多克隆抗体，为研究禽类细胞因子参与先 天免疫和信号通路的调控提供了技术支持。1.鸭 MAPK1 和 NOD1 的克隆、表达和蛋白纯化本研究根据 GenBank 上发表的鸡 MAPK1 和 NOD1 基因序列分别设计特异性引物， 提取樱桃谷鸭脾脏组织总 RNA ，通过 RT-PCR 和 cDNA 末端 RACE 技术，首次成 功克隆得到鸭 MAPK1 和 NOD1 基因。对得到的基因序列进行分析，结果表明本研究 通过 RT-PCR 和 RACE 技术克隆得到的鸭 MAPK1 基因大小为 1 557 bp，基因序列中 56～1162 bp 为其 ORF 区域，编码 369 个氨基酸；通过 RT-PCR 技术克隆得到鸭 NOD1 基因大小为 2 756 bp。同源性分析结果表明鸭 MAPK1 编码区的核苷酸序列与人、鼠、 鸡的核苷酸序列分具有 85.4%、84.5%和 97.3%的同源性，它们的氨基酸序列分具有 96.4%、97.2%、98.6%的同源性；鸭 NOD1 编码区的核苷酸序列与人、鼠、鸡的核苷 酸序列分具有 59.2%、57.4%和 88.8%的同源性，它们的氨基酸序列分具有 62.9%、 61.1%、91.9%的同源性。将鸭 MAPK1 基因克隆至原核表达载体 pET-28a 中，成功构建了原核表达载体， 命名为 pET-MAPK1，将重组表达载体转化到大肠杆菌 Rosetta 中，经过 IPTG 低温诱 导表达，表达的重组蛋白经蛋白纯化柱进行纯化。SDS的结果表明，鸭 MAPK1 重组蛋白在大肠杆菌 Rosetta 中以可溶性的方式成功表达，重组蛋白的相对分子质量 约为 42 kDa。MAPK1 重组蛋白成功的原核表达和纯化，为后续制备其单克隆抗体和 多克隆抗体奠定了基础。2.鸭 MAPK1 抗体的制备1）单克隆抗体的制备： 为了制备抗鸭 MAPK1 的单克隆抗体，利用纯化的 MAPK1 重组蛋白与等体积的弗氏佐剂充分震荡、乳化，每隔两周以皮下注射方式免 疫 BALB/c 小鼠，3 次免疫后测定抗体效价。取具有高抗体效价免疫小鼠的脾脏细胞 与 SP/20 骨髓瘤细胞进行融合，用间接 ELISA 方法筛选鸭 MAPK1 的阳性单克隆细 胞株。使用有限稀释法进行筛选，并通过 3 次亚克隆之后，得到能稳定分泌单克隆的I两株杂交瘤细胞株，制备了两株小鼠腹水单克隆抗体。采用建立的间接 ELISA 法测定获得腹水的效价，结果表明，两株单克隆抗体的效价均达到 1 :12 800。Western blot 试验表明两株单克隆抗体对其抗原蛋白的结合性好、特异性强。使用单克隆抗体亚型 分类试剂盒进行亚类鉴定，结果表明两株单克隆抗体均为 IgG1 型。2）多克隆抗体的制备：利用纯化的 MAPK1 重组蛋白与等体积的弗氏佐剂充分震荡、乳化，每隔两周以皮下注射方式免疫新西兰白兔。经 4 次免疫之后，ELISA 检 测其血清效价为 1 :25 600。Western blot 检测结果表明制备的鸭 MAPK1 血清抗体特 异性良好。3.鸭 MAPK1 和 NOD1 实时荧光定量 PCR 检测方法的建立和初步应用依据获得的鸭 MAPK1 和 NOD1 基因序列设计引物，建立了鸭 MAPK1 和 NOD1 的实时荧光定量 PCR 检测方法。同时对凋亡相关碱性蛋白（Arbp）进行引物设计用 作检测对照。以鸭脾脏 mRNA 反转录获得的 cDNA 作为模板，构建质粒用作阳性标 准品，建立检测鸭 MAPK1 和 NOD1 转录水平的实时荧光定量 PCR 检测方法。结果 显示，建立的实时荧光定量 PCR 方法对鸭 MAPK1 和 NOD1mRNA 的最低检测量分别 为 103 和 102 个拷贝，在 1012～103 拷贝范围内线性关系很好，R2 均大于 0.996，并且 该方法的特异性和重复性较好。对感染鸭疫里默氏杆菌 Yb2 株樱桃谷鸭的检测结果 表明，其脾脏中 MAPK1 和 NOD1 转录水平均明显上调，表明该方法可用于临床检测， 为进一步研制检测试剂盒提供了技术支持。关键词：鸭；MAPK1；NOD1；单克隆抗体；实时荧光定量 PCRIIAbstractCytokines play important roles o