梅花鹿 Col Χ 基因的 RNAi 重组慢病毒载体的构建及 鉴定.PDFVIP

梅花鹿Col Χ 基因的RNAi 重组慢病毒载体的构建及 鉴定 1,2 2 2 2 2 褚文辉 赵海平 杨福合 邢秀梅 李春义 * （1.江苏科技大学 生物与环境工程学院 镇江 212018 ；2. 中国农业科学院特产研究所吉林 省特种经济动物分子生物学省部共建实验室 特种经济动物种质资源遗传改良重点开放实验 室 吉林 132109 ） Construction and Characterization of Lentiviral Vector of RNA Interference of Collagen Type Χ Gene of Sika Deer CHU Wen-hui1,2 2 2 2 2 ZHAO Hai-ping YANG Fu-he XING Xiu-mei LI Chun-yi * (1.Jiangsu University of Science and Technology School of Biotechnology and Environmental engineering Zhenjiang 212018; 2. Institute of Special wild Economic Animal and Plant Science CAAS. Jilin 132019 ） 摘要：研究十型胶原蛋白（Collagen type Ⅹ，ColΧ)，在软骨内成骨过程中所起的作用。 本研究针对梅花鹿 Col Χ基因设计筛选 2 条高分 RNAi 靶序列，在 T4 DNA 连接酶的作用下 分别与慢病毒载体质粒 plvthm 连接，形成重组质粒 S2-plvthm/S3-plvthm；PCR 筛选阳性克 隆并测序鉴定。用 Lipofectamine 2000 介导 S2-plvthm/S3-plvthm，pCMVdr8.91，pMD2G 三质粒共转染 293T 细胞。结果显示：转染 24 小时后，观察到表达荧光蛋白的 293T 细胞。 收集培养液后进行 1 000 克离心力 离心 5 分钟，所得上清液含有重组慢病毒的组分。 S2-plvthm/S3-plvthm 上清液中病毒滴度分别达到 9.96 ×107 7 TU/升和 7.18 ×10 TU/升。以此 病毒感染梅花鹿角柄骨膜细胞，并进行微粒体培养，72 小时后出现肉眼可见的白色微团， 该细胞团有荧光表达。本试验成功地构建了针对梅花鹿 Col Χ基因的慢病毒载体，为了研 究 Col Χ蛋白在鹿茸角骨化中的作用奠定了基础。 关键词：鹿茸；角柄；Col Χ基因；RNAi；慢病毒载体；微粒体培养 软骨内成骨是骨形成过程中的重要步骤，其主要包括间质细胞的快速增殖并分化为前成 软骨细胞，前成软骨细胞进一步分化为软骨细胞，当软骨细胞发育到一定的成熟阶段开始变 得肥大时，便开始大量表达十型胶原纤维蛋白（Col Χ）。因此，Col Χ蛋白是软骨内成骨 过程中肥大型软骨阶段的一种可靠标志，弄清Col Χ蛋白在成骨过程中的作用对成骨机理的 探索具有重要的理论和实际意义。 研究表明在哺乳动物的关节软骨与韧带的结合处，及牙齿釉质基质中均有不同程度的 Col Χ表达，在禽类的长骨及胫骨生长板中也发现Col Χ蛋白的表达。Col Χ蛋白在软骨内 成骨过程中的作用一直存在争议，有研究者推测其为一种发育调控蛋白，但是也有人认为它 仅是一种普通的结构蛋白。Rita等建立了一个Col Χ基因缺失型小鼠模型，结果发现这只缺 失型小鼠长骨的生长发育在形态学和组织学上与正常小鼠无大异常，生活也很正常且能生育。 但是也有报道称，人的Col Χ基因突变可导致干骺端软骨发育异常。在Col