第十四章基因工程 PPT课件.ppt

第 十 四 章 基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第21章） 循环次数　 三、重组技术与医学的关系 疾病基因的发现与克隆 生物制药 基因诊断 基因治疗 遗传疾病的预防 三、重组技术与医学的关系 summary 1. Recombinant DNA technology builds on a few basic techniques: isolation of DNA, cleavage of DNA at particular sequences, ligation of DNA fragments, introduction of DNA into host cells, replication of DNA, and identification of host cells that contain recombinants. 2. A genomic library represents all the DNA of an organism; A cDNA library contains DNA that is complementary to the mRNA from a particular cell or tissue. 3. Fragments of DNA generated by restriction endonucleases are incorporated into vectors, which can be plasmids, bacteriophages, viruses, or artificial chromosomes. 4. Cells containing the desired recombinant are identified by screening. 5. Specific DNA sequences can be amplified by the polymerase chain reaction (PCR). 目的DNA（特异性）拷贝数增加 2n倍 模板DNA （基因组DNA）拷贝数增加一倍 产物 反应过程：变性、退火 、延伸（三阶段，多循环） 起始（模板DNA解链、形成引发体）、延伸、终止（三阶段） 反应过程 buffer，三种变化的温度（94，50-70，72 ℃），cycles（25-35） 胞液环境，37 ℃ 反应条件 DNA polymease Topo异构酶，解旋酶，引物酶， DNA聚合酶，连接酶 酶 template DNA（genomic DNA ，cDNA），a pair of specific primers，dNTPs template DNA（genomic DNA ），RNA primer，dNTPs 原料 PCR DNA的体内复制 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 2. 平端连接 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌