异源性表达sh3-p85对a型流感病毒复制的抑制作用-inhibitory effect of heterologous expression sh3 - p85 on replication of influenza a virus.docxVIP

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2018-06-04 发布于上海
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异源性表达sh3-p85对a型流感病毒复制的抑制作用-inhibitory effect of heterologous expression sh3 - p85 on replication of influenza a virus.docx

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异源性表达sh3-p85对a型流感病毒复制的抑制作用-inhibitory effect of heterologous expression sh3 - p85 on replication of influenza a virus

efficientpropagationofinfluenzaAvirus,inthisstudy,weexaminedtheeffectofheterologousSH3(h-SH3)on(i)thereplicabilityoffivestrainsofinfluenzaAvirusfromthreesubtypes(H1N1,H3N2,andH9N2)ininfectedcellsand(ii)thephosphorylationstatusofAktafterviralinfection.MaterialsandMethodsSH3domain(9-79aa)ofp85βsubunitwasclonedintoPNFvector(amodifiedpcDNA3plasmidwithanN-terminalFlagtag)attheBamHIandEcoRIsitestogeneratepSH3.Full-lengthNS1sequenceofH1N1,H3N2,orH9N2viruseswasclonedintopEGFP-c1attheBamHIsitetogeneratepNS11,pNS32,orpNS92plasmids,respectively.TheconstructswereverifiedbyDNAsequencing.Co-localizationanalysisbyconfocalmicroscopyMDCKcellculturesontheglasscoverslipsweretransfectedwithindicatedplasmidsfor24h.ImageswerecapturedwiththeOlympusconfocalmicroscopy.Transienttransfection,viralinfection,anddeterminationofantiviralactivityMDCKcellswereseededontosix-wellplatesandtransfectedwithpSH3orPNFemptyvectorfor48h.MDCKcellswereinfectedwithinfluenzaAvirusesat(MOI)of0.001.Analiquotofthesupernatantwasharvestedevery12handvirusyieldwastitratedbyplaqueassayinMDCKcells.Westernblot-basedphosphorylationassayMDCKcellstransfectedwithindicatedplasmidsfor24hwereinfectedwithdifferentinfluenzaAvirusstrainsatanMOIof2.At8hpostinfectionthecellswerelysedandWesternblotwasfollowed.ImmunoblotsweredevelopedusingtheEnhancedchemiluminescence(ECL)reagents.QuantityOne(Bio-Rad)softwarewasusedtoanalyzeimages.DeterminationofPI3KeffectonthereplicationofST364andPR8virusesMDCKcellswith100%confluencewerepretreatedwith10uMor50uMLY294002(aspecificPI3Kinhibitor).After2h,MDCKcellswereinfectedwithST364virusorPR8virus,andplaqueassaywasperformed.Resultsandconclusions1.Co-localizationofh-SH3andNS1ConfocalmicroscopywasusedtomonitortheMDCKcellsthatweretransientlyco-expressingh-SH3andNS1(NS11,NS32,orNS92).Wefoundthath-SH3andNS1mainlypresenteddiffuseddistributionorsomedot-likestructureswithinthenucleus,andh-SH3locatedatthesamepositionasNS1whichsuggestedtheinteractionbetweenh-SH3andNS1.Subcellularlocalizationinthisstudyshowedthatin