吲哚胺23-双加氧酶基因转染对肝癌细胞的凋亡及相关机制的实验分析-experimental analysis of apoptosis and related mechanisms of indoleamine 23 - dioxygenase gene transfection on hepatocellular carcinoma cells.docxVIP

吲哚胺2，3-双加氧酶基因转染对肝癌细胞的凋亡及相关机制的实验研究摘要目的肝癌患者的免疫系统不能有效地清除或杀伤癌细胞，是导致肝癌难以治愈、复发和转移的重要因素之一。吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)是一种可使机体产生获得性免疫耐受的酶类，也是肝脏以外唯一可催化色氨酸氧化裂解的限速酶。研究表明在多个肿瘤组织中IDO的高表达与调节性T细胞(RegulatoryTcell,Treg)浸润数量增多有关，故IDO和Treg细胞有望成为潜在的生物治疗靶点。本研究旨在探讨肝癌环境中IDO的高表达与Treg细胞的数量关系，以及对肝癌细胞和T淋巴细胞的作用，为肝癌的生物和免疫治疗提供新的理论基础和临床依据。方法提取健康人外周血中的T细胞利用细胞培养和基因转染技术将T细胞和肝癌细胞混合培养。实验分为六组:根据是否加入D-1-MT分为未干预组和干预组，每组根据培养细胞的不同又分为T细胞与HepG2细胞组、T细胞与pcDNA3.1-HepG2细胞组、T细胞与pcDNA3.1-IDO-HepG2细胞组。于混合培养2天后应用流式细胞术、MTT法检测各组中HepG2细胞的凋亡情况和T细胞抗HepG2细胞的细胞毒活性。在混合培养5天后应用流式细胞术检测Treg细胞的比例。并建立人肝癌细胞小鼠模型，用流式细胞仪检测荷瘤小鼠外周血中Treg细胞的比例。结果1、流式细胞仪分析混合反应体系中HepG2细胞的凋亡率，未干预组中高表达IDO的pcDNA3.1-IDO-HepG2细胞早期凋亡率明显低于pcDNA3.1-HepG2细胞和普通HepG2细胞，分别为(1.65±0.14)%，(7.17±0.24)%，(6.93±0.33)%，前者与后二者比较差异具有统计学意义(P0.05)；而干预组中HepG2细胞凋亡率均高于干预前，即(4.41±0.70)%，(10.50±1.51)%，(11.55±1.05)%，干预前后比较有统计学意义(P0.05)。2、MTT实验显示，未干预组中IDO-HepG2细胞组T细胞抗HepG2细胞的细胞毒活性明显低于空质粒转染组和空白对照组，其测定值为(35.00±2.20)%，(74.51±1.44)%，(75.30±1.67)%，前者与后二者比较有统计学意义(P0.05)；而1-MT干预后，T细胞抗HepG2细胞的细胞毒活性均高于未干预组，即(71.33±2.10)%,(81.27±2.42)%,(80.91±1.95)%，干预前后差异有统计学意义(P0.05)。3、流式细胞仪分析混合反应体系中Treg细胞的比例，未干预组中IDO-HepG2细胞组Treg细胞比例明显高于空质粒转染组和空白对照组,即（10.53±1.05）%，（4.03±0.17）%，（3.34±0.18）%，前者与后二者比较有统计学意义(P0.05)；分别加入1-MT干预后，Treg细胞比例均低于未用1-MT干预组，其值为（6.37±0.15）%，（1.43±0.10）%，（1.57±0.13）%，干预前后差异有统计学意义(P0.05)。4、人肝癌小鼠模型中，流式细胞仪分析小鼠外周血中Treg细胞的比例，高表达IDO的荷瘤小鼠外周血Treg细胞比例明显高于空质粒转染组和空白对照组，即（15.33±1.18）%，（8.96±0.53）%，（8.14±0.57）%，前者与后二者比较有统计学意义(P0.05)。结论1、IDO可能通过增加调节性T细胞的比例来抑制肝癌细胞（HepG2细胞）的凋亡和T细胞的免疫毒性功能。1-MT可抑制IDO的这种作用。2、在体实验证实IDO的过量表达可提高外周血Treg细胞的比例。关键词吲哚胺2，3-双加氧酶，肝癌细胞，T淋巴细胞，Treg细胞，凋亡Effectsofhepatocellularcarcinomacells’apoptosisandtherelatedmechanismsafterindoleamine2,3-dioxygenasegenetransfection.AbstractObjectsHepatocellularcarcinomapatientsimmunesystemscannoteffectivelyremoveorkillcancercells,itisoneoftheimportantfactorstocausethatlivercancerareincurable.Indoleamine2,3-dioxygenase(IDO)catalyzestherate-limitingstepoftryptophandegradationalongthekynureninepathway，andalsocanmakethebodytoproduceacquiredimmu