吲哚胺2,3双加氧酶调节血管平滑肌细胞表型转换的体外研究-in vitro study of indoleamine 2,3 dioxygenase regulating phenotype transformation of vascular smooth muscle cells.docxVIP

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研 究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的 地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文 的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅 和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据 库。 ，本论文属于 ， 保密 ，，在 年解密后适用本授权书。 不保密 。 （请在以上方框内打“√” ） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 天津医科大学硕士学位论文 天津医科大学硕士学位论文 中文摘要 目的：为探索吲哚胺 2，3 双加氧酶（indoleamine 2, 3-dioxygenase，IDO） 及其 代谢 微 环 境 （ 低 色 氨 酸 及 色 氨 酸 代 谢 产 物 堆 积 ） 在 动 脉 硬 化 闭 塞 症 （atherosclerotic occlusive，ASO）、经皮动脉腔内血管成形术（percutaneous transluminal angioplasty，PTA）及支架植入术后再狭窄（restenosis，RS）等病理 过程中的作用，本实验研究其体外对血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscular Cell, VSMC)增殖及表型转换的影响。 方法：采用血管环翻转贴壁法原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞（SMCs）， 并对其进行平滑肌α-肌动蛋白（SM α-actin）免疫细胞化学法（immunocyto- chemistry，ICC）鉴定；应用低色氨酸（Low-tryptophan，L-Trp）及其代谢产物 犬尿氨酸（Kynurenine，KYN）培养并观察对其增殖能力及表型基因表达的影响； 通过与高表达 IDO 的小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA, ATCC? CRL-2586 ?）联合 培养，利用 MTT 法检测其增殖情况，并应用实时荧光定量聚合酶链式反应 （quantified real time PCR, qRT-PCR）检测其表型基因的表达水平上的差异。使 用 SPSS 19.0 软件包进行数据分析。 结果：经上述方法体外培养主动脉 SMCs，5-10 天可有细胞萌出，每取材 2 只小鼠可获得约 6×105 个二代 SMCs，传至第三代时细胞生长呈典型的“峰”和“谷” 形态，经 SM α-actin 免疫组化鉴定呈阳性（棕色），细胞纯度达 95%以上。3-10 代细胞增殖旺盛，形态典型，细胞传代至 10-12 代以后细胞形态变化较大，生长 缓慢，凋亡增多。取 3-5 代 SMCs 用于后续实验。L-Trp 可以较为明显抑制 SMCs 的增殖，但其代谢产物 KYN 则只有在高浓度下才会对 SMCs 的增殖产生抑制作 用，而且这种抑制作用在培养 96 小时后才会表现出来，qRT-PCR 显示：在 120 小时的培养时间内，无论是 L-Trp 还是 KYN 培养均未对 SMCs 收缩表型基因 Smoothelin-B 的表达产生显著影响，单纯 KYN（200μM）培养对合成表型基因 Syndecan-1 的表达亦未产生明显影响，而只有 L-Trp（10μM）及 L-Trp+KYN 联 合培养组在培养 72h、96h、120h 时 Syndecan-1 的表达显著下调。考虑可能是单 纯色氨酸饥饿环境产生的影响，而代谢产物 KYN（200μM）并不能显著影响此 两种表型基因的表达。SMCs 与高表达小鼠 IDO 的 EOMA 共培养后 96h、120h 后，SMCs 的增殖受到抑制，而添加 IDO 特异性抑制剂 1-mT（1-methyl tryptophan， I 1-甲基色氨酸）后这种抑制作用消失，提示 IDO 对 SMCs 的增殖产生抑制作用。 qRT-PCR 结果提示平滑肌细胞 Smoothelin-B 在与 EOMAIDO+共培养 96h、120h 后表达显著上调，Syndecan-1 则在共培养 120h 后表达下调，添加 1-mT 后这种 效应被削弱。 结论：采用改良的血管环翻转贴壁法能获得高纯度的 SMCs，简单易行，且 有效避免了外膜成纤维细胞及内膜内皮细胞的污染。可为实验研究提供细胞材 料。低色氨酸（10μM）可抑制平滑肌细胞的增殖，而其代谢产物 KYN 只有在 高浓度（200μM）下才产生这种抑制作用，不认为两者对 SM