人cu，zn-sod在毕赤酵母中克隆表达的研讨.pdfVIP

摘 要 超氧化物歧化酶(Superoxide 重要的作用，它是一类广泛存在于生物体的各个组织中的金属酶。 巴斯德毕赤 酵母(Pichiapastoris)是一种甲基营养型酵母。 本文构建表达入Cu,Zn．SOD的重组酵母工程菌株，在摇瓶水平探索不同外 界条件对培养上清酶活性的影响，测试目的蛋白酶的稳定性。根据酵母密码子偏 好性，化学合成人cu洳一SOD基因，克隆至真核表达载体pPlCgK中，将 筛选高拷贝转化子，并用甲醇诱导表达。表达产物进行SDS．PAGE(12％)和 Western blot检测。用Lowry法测定蛋自含量，用改进的邻苯三酚法测定目的蛋 白酶活性，测定不同外界条件下培养液上清中的酶活性，测试粗酶液对化学试剂， 相对分子量为18KD左右，低糖基化，目的蛋白占外分泌蛋白总量的27％，Lowry 法测定目的蛋白最高表达量为91mg／L。活性测定实验结果表明，最佳条件下培 养液上清的酶活性为334U／ml，粗酶对氯仿和乙醇稳定，对H202不稳定，粗酶 对温度和pH都较稳定。最佳发酵条件初步确定为初始pH6．0，维持甲醇浓度 1+5％，持续培养96小时。在毕赤酵母GSll5细胞内成功表达了具备酶活性的人 Cu,Zn-SOD。初步确定了发酵的的最佳条件和粗酶液对化学试剂，温度和pH的稳 定