gabaa受体调节动脉粥样硬化的作用及其机制的研究-study on the role of gabaa receptor in regulating atherosclerosis and its mechanism.docx

GABA-A 受体调节动脉粥样硬化的作用及其机制的研究博士研究生杨颖导师程龙献教授中文摘要第一部分GABA和GABA-A受体激动剂托吡酯对THP-1源性泡沫细胞形成的研究目的探讨GABA和GABA-A受体激动剂托吡酯对THP-1 源性泡沫细胞形成的影响方法THP-1源性巨噬细胞分为空白对照组，ox-LDL组，GABA组，1μM、100nM、1mMGABA+ox-LDL组。干预结束后，油红O染色观察各组巨噬细胞内脂滴的多少及泡沫细胞的数量；Western blot 检测THP-1源性巨噬细胞上SR-A、CD36、LOX-1、ACAT1、ABCA1、ABCG1 及SR-B I的蛋白表达水平。将GABA改换为GABA-A受体激动剂托吡酯，THP-1源性巨噬细胞分为空白对照组，ox-LDL组，托吡酯组，2μM、20μM、200μM托吡酯+ox-LDL组，再次重复油红O染色和Westernblot检测实验。结果油红O染色发现GABA和GABA-A受体激动剂托吡酯能够减少THP-1源性的巨噬细胞内脂滴的含量，从而减少泡沫细胞的数目。进一步的机制研究表明GABA 和GABA-A受体激动剂托吡酯下调巨噬细胞上SR-A、CD36、LOX-1 和ACAT1 的蛋白表达水平，上调ABCA1、ABCG1和SR-BI的蛋白表达水平。结论GABA 和GABA-A 受体激动剂托吡酯能够减少THP-1 源性的巨噬细胞吞噬ox-LDL的能力，抑制泡沫细胞的形成。关键词THP-1 细胞；GABA；托吡酯；清道夫受体家族；ATP 结合盒转运体第二部分GABA-A受体影响apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的作用及其机制的研究目的探讨GABA-A受体激动剂以及拮抗剂对apoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块形成的作用及其机制。方法6 周龄的apoE-/-小鼠随机分为普食组、高脂饮食组、高脂饮食+印防己毒素组、高脂饮食+荷包牡丹碱组、高脂饮食+托吡酯组，每组12只小鼠。在分别给予生理盐水、生理盐水、印防己毒素、荷包牡丹碱、托吡酯腹腔注射12周后，进行下述指标的检测：主动脉油红O染色计算脂质斑块的面积；主动脉根部横切面冰冻切片形态学染色观察斑块内胶原纤维的含量，免疫组化染色观察斑块内巨噬细胞、CD3+T淋巴细胞的数目；实时定量PCR 法检测MCP-1、IFNγ的mRNA表达；Westernblot 检测与巨噬细胞脂质代谢相关的蛋白（SR-A、LOX-1 、ACAT1、ABCA1/G1、SR-BI）以及信号通路蛋白（p38MAPK、P-p38MAPK、AKT、PAKT）的表达；EMAS 检测主动脉细胞内NF-κB的活性；流式细胞术检测脾细胞中Th1、Th17 和Treg细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的比例。结果每组小鼠主动脉内膜面均有脂质斑块形成。与高脂饮食组比较，普食组和托吡酯组脂质斑块的面积明显减少，而印防己毒素组和荷包牡丹碱组则呈现相反的趋势。与其他三组比较，普通饮食组和托吡酯给药组两组胶原纤维的含量明显降低。与高脂饮食组比较，普食组和托吡酯组脂质斑块内巨噬细胞的数量明显减少，印防己毒素组和荷包牡丹碱组则显著增加。斑块内CD3+T淋巴细胞的数目在各组之间没有差异。与高脂饮食组比较，普食组和托吡酯组斑块中MCP-1 的mRNA表达上调，在印防己毒素组和荷包牡丹碱组表现为下调。IFNγ的mRNA表达在各组之间没有差异。与高脂饮食组比较，普食组斑块内SR-BI的蛋白表达明显增加，ACAT1、SR-A的蛋白表达明显减少；托吡酯组斑块内ABCA1、ABCG1、SR-BI的蛋白表达明显增加，SR-A、LOX-1 的蛋白表达明显减少；印防己毒素组斑块内ABCA1、ABCG1的蛋白表达明显减少，ACAT1的蛋白表达明显增加；荷包牡丹碱组斑块内ABCA1、SR-BI的蛋白表达明显减少，ACAT1、SR-A的蛋白表达明显增加。与高脂饮食组比较，P-pMAPK38 的蛋白表达在普食组、托吡酯组增加，而印防己毒素组和荷包牡丹碱组无明显变化。P-AKT的蛋白表达除了普食组较高脂组有所减少外（未达到统计学差异），余各组之间没有改变。主动脉细胞内NF-κB的活性依次为托吡酯组普食组高脂饮食组、印防己毒素组、荷包牡丹碱组。脾细胞中Th1、Treg和Th17 细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的比例除普食组的Th17 数目较其他各组明显减少外，余亚群各组间比较没有差异。结论GABA-A受体激动剂托吡酯可抑制apoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块的形成。机制可能为通过下调MCP-1的mRNA和P-pMAPK38的蛋白表达，从而减少内膜下巨噬细胞的渗透和增殖；增加巨噬细胞膜上胆固醇流入蛋白（ABCA1、ABCG1、SR-BI）的表达，减少胆固醇逆转运蛋白SR-A、LOX-1的表达，抑制巨噬源性泡沫细胞的形成。