沉默TRPV基因对利多卡因所致细胞凋亡的影响及其机制.docxVIP

分类号： U D C ： 密级： 学号：416523713076 南 昌 大 学 专 业 学 位 研 究 生 学 位 论 文 沉默 TRPV1 基因对利多卡因所致细胞凋亡 的影响及其机制 Effect of TRPV1 gene silence on cell apoptosis induced by lidocaine and its mechanism 琚幼婷 培养单位（院、系）：南昌大学 指导教师姓名、职称：胡衍辉 主任医师 专业学位种类：临床医学硕士 论文答辩日期：2013.5.30 答辩委员会主席： 评阅人： 年 月 日 学位论文独创性声明 一、学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名（手写）： 签字日期： 年 月 日 二、学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论 文。同时授权北京股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志 社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位 论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按 “章程”规定享受相关权益。 学位论文作者签名（手写）： 导师签名（手写）： 签字日期： 论文题目 年 月 日 签字日期： 年 月 日 姓 名 学号 论文级别 博士□ 硕士□ 院/系/所 E_mail 专业 备注： □公开 □保密（向校学位办申请获批准为“保密”， 年 月后公开） 摘要 摘 要 目的： 构建针对人 TRPV1基因的 pSUPERretro-puro TRPV1逆转录病毒表达载体， 感染 U87-MG 细胞，观测其沉默 TRPV1 基因的效果。通过沉默 TRPV1 基因观 测利多卡因处理后对 U87-MG 的细胞状态和凋亡情况的影响，以探讨利多卡因 是否通过 TRPV1 产生神经毒性损伤。 方法： 利用 Ambion 在线设计软件设计针对人 TRPV1 基因的 shRNA 干扰序列， 克隆到 pSUPERretro-puro 载体上。对重组质粒进行 DNA 序列测定和酶切分析。 用磷酸钙法制备 pSUPERretro-puro TRPV1 逆转录病毒，将其感染到 U87-MG 细胞，经嘌呤酶素筛选阳性克隆后采用荧光定量 PCR 及 Western blotting 法检测 TRPV1 表达。U87-MG 的细胞分为空白对照组、基因沉默组以及空载体组。对 于每个组的细胞，我们利用流式细胞技术，研究利多卡因处理后不同时间点的 细胞内钙离子浓度及线粒体膜电位情况。并通过 MTT 方法和流式细胞术，检测 U87-MG 细胞的活力和凋亡情况。 结果： 经 DNA 测序和酶切鉴定表明，pSUPERretro-puro TRPV1 表达载体构建成 功。pSUPERretro-puro TRPV1 逆转录病毒感染 U87-MG 细胞后，细胞中 TRPV1 表达量明显降低。U87-MG 细胞活力随着利多卡因处理浓度增高而降低。利多 卡因处理各组细胞后随着时间增加，细胞内钙离子浓度逐渐上升。TRVP1 基因 沉默组的各时点钙离子浓度显著比其他各组低（P0.05）。利多卡因处理后，对 照组 U87-MG 细胞的线粒体膜电位明显下降，而在 TRVP1 基因沉默组线粒体 膜电位较高（P0.05）。同时，流式细胞结果显示，利多卡因处理后，各组的细 胞凋亡增高，而在 TRVP1 基因沉默组则明显低于对照组（P0.05）。 结论： 成功构建了针对人 TRPV1 基因的 pSUPERretro-puro TRPV1 表达载体。 pSUPERretro-puro TRPV1 能有效下调 TRPV1 基因在 U87-MG 细胞中的表达。 利多卡因可导致 U87-MG 细胞内钙离子浓度增高，线粒体膜电位降低和细胞凋 I 摘要 亡增多。同时，沉默 TRPV1 基因可降低利多卡因的这些损伤作用。这提示 TRPV1 与利多卡因神经毒性损伤机制有关。利多卡因可能通过激活 TRPV1 通道蛋白来 增加细胞内钙离子浓度，降低线粒体膜电位并介导细胞凋亡。 关键词：利多卡因；瞬态电压感受器阳离子通道；钙超载；凋亡 II Abstract