COMT基因单核苷酸多态性与汉族白癜风发病相关性.docVIP

COMT基因单核苷酸多态性与汉族白癜风发病相关性 　　[摘要]目的：探讨COMT基因单核苷酸多态性与汉族寻常型白癜风发病的相关性。方法：测定377例汉族寻常型白癜风患者及388例正常对照的儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)基因第4外显子158密码子碱基多态性。抗凝血抽提DNA，用PCR－SSP法和PCR产物直接测序法鉴定基因型，对结果进行统计学分析处理。结果：COMT基因第4号外显子存在一个G＞A点突变，表现为GG纯合、AA纯合，GA杂合三种基因型，使其编码的第158氨基酸由缬氨酸(Val)变成蛋氨酸(Met)。病例组A频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：COMT－158位点的多态性与汉族寻常型白癜风具有明确相关性。 　　[关键词]白癜风；多态性；PCR～SSP；COMT基因 　　[中图分类号]R758.41　[文献标识码]A　[文章编号]1008－6455(2007)03－0365－03 　　 　　白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，由于各种原因导致黑素细胞数目减少或功能丧失，表现为皮肤局部白斑，严重影响患者生活质量。目前白癜风的发病机制有多种学说，包括自身免疫学说、细胞毒学说、神经学说等，其中由于代谢异常导致局部黑素细胞毒性损伤的学说日渐受到重视。儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)催化儿茶酚胺第3位羟基甲基化，是降解儿茶酚胺的主要代谢酶。文献表明COMT基因第4号外显子存在一个G＞A点突变使158密码子从缬氨酸(Val)到蛋氨酸(Met)错义突变，COMT酶活性改变，引起黑素细胞微环境毒性儿茶酚胺过量表达，从而导致黑素细胞结构和功能破坏。对中国汉族人而言，目前尚未见该基因位点多态性和白癜风的相关报道。本研究中，我们对COMT－158 G＞T单核苷酸基因多态性与白癜风发病的关系进行了深入研究。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　一般资料：377例白癜风患者均来自西京医院皮肤科门诊，388名健康成年汉族人来自门诊健康查体者。均无遗传病家族史，无肿瘤、风湿病及神经系统疾病等。治疗组平均年龄(24.7±13.6)岁，对照组平均年龄(26.4±13.3)岁(P＝0.703)。 　　 　　1．2　DNA提取：患者填写知情同意书，抽静脉血10ml，枸橼酸钠抗凝，利用血液DNA提取试剂盒提取DNA，采取紫外分光光度计检测DNA浓度(mg/m1)和纯度(OD260/OD180)。 ???　 　　1．3　COMT基因型的检测：引物特异性聚合酶链式反应(PCR－SSP)：引物设计利用Oligo Primer 5.0PCR引物设计软件，分别针对COMT－158单核苷酸多态性位点设计相应引物(表1)。PCR总反应体系20μ1：10×缓冲液2.5L，20mmol/L MgCl22.5L，25mmol/L dNYP混合物0.2μl，20pmol/L上下游引物各1μl，5 U/μl Taq酶0.3μl，基因组DNA1μl，加高压灭菌去离子水至20μl。循环条件为96℃1min，96℃变性20s，75℃退火30s，70℃延伸45s五个循环，之后96℃变性25s，65℃退火50s，72℃延伸30s 21个循环，之后96℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s五个循环，最后20℃ 2min。G等位基因PCR产物455bp，A等位基因PCR产物322bp。通过1.5％琼酯糖水平凝胶电泳分离鉴定基因型，以DL2000 DNA ladder(Takara)作分子量标准品。 　　 　　1．4　统计方法：基因型和等位基因频率采用直接计数法，用Hardy－Weinberg检测样本是否符合孟德尔遗传规律；基因型和等位基因频率差异比较分别采用卡方检测，计算比值比(0R)以及95％可信区间(CI)来判断基因COMT－158 G＞A多态现象与白癜风发病的相关性，采用SAS统计分析软件处理(version 8.2；SAS Institute，Inc，Cary，NorthCarolina)。 　　 　　2　结果 　　 　　2．1　等位基因与基因型：图1所示为2种等位基因和3种基因型电泳图。GG基因型只可见G组引物扩增PCR产物条带，从基因型只可见A组引物扩增PCR产物条带，GA型可见G组、A组两组引物扩增PCR产物条带。测序进一步验证COMT－158碱基存在二态性，其碱基可为G或A，在人群中表现为GG纯合子，AA纯合子和GA杂合子3种基因型，其碱基变化改变了氨基酸编码，由缬氨酸(Val)变为蛋氨酸(Met)。 　　 　　2．2　基因多态性：3种基因型在所研究汉族正常对照群体中的分布经Hardy－weinberg定律吻合度检测，达到遗传平衡(P=0.227)，说明群体基因遗传平衡，数据来