原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
HAC70-多肽复合物疫苗对实验性肿瘤细胞抗肿瘤活性研究
HAC70-多肽复合物疫苗对实验性肿瘤细胞抗肿瘤活性研究
【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2009)06-0137-03
【摘要】目的：观察从艾氏腹水瘤细胞中提取的热休克蛋白70-抗原肽复合物(HAC70)诱导的抗肿瘤免疫效应，探讨其抗肿瘤机制。方法：提取热休克后的小鼠艾氏腹水瘤细胞内热休克蛋白70(HSP70)经肝素-琼脂糖亲和层析纯化，制成热休克蛋白-肽复合物疫苗，以体内免疫法检测HAC70的抑瘤作用，3H-TdR掺入释放法检测脾细胞对肿瘤细胞的抗肿瘤活性。结果：经HAC70免疫的荷瘤小鼠皮下肿瘤结节平均重(1.26±0.4)g，较对照组(3.14±0.56)g明显减轻(P[1]，观察其抗肿瘤作用，并以3H-TdR释放法检测HAC70诱导机体产生的特异性杀伤活性，报告如下：
1 材料与方法
1.1 动物：BALB/c小鼠(16～18g，由中国医科大学试验动物中心提供)。
1.2 药品与试剂：肝素-Sepharose凝胶(Phrmacia公司提供)；DNAsel(Sigma公司提供)；rIL-2、聚乙二醇(华美公司)；胎牛血清(Hyclone公司提供)；3H-TdR释放法试剂盒(中国原子能研究所)。
1.3 仪器：低温超速离心机(日立公司)；UV-1601型紫外可见光分光光度计、CO2孵箱(SHIMADZU公司)；双道液体闪烁计数器(二六二厂)。
1.4 实验方法
1.4.1 艾氏腹水瘤细胞热休克：取新鲜腹水0.5ml，用含小牛血清(10%)的完全培养基分装于eppendorf管中(细胞浓度为2.0×106/ml，0.5ml/管)，分别置42℃、43℃和44℃水浴中热休克2、4、6、8、10和12h，继之于37℃通以5%CO2的孵箱中恢复2h，倒置显微镜下计数活肿瘤细胞数。
1.4.2 制备HAC70：取成功接种艾氏腹水瘤细胞7d后的小鼠，拉颈处死，无菌提取腹水，离心(50～60×g-5min)，弃上清，以无血清RPIM 1640洗2～3次，移入200ml培养瓶中(约50ml/瓶)，密封，并置42℃水浴中热休克10h。热休克后的细胞离心、超声破碎细胞，超速离心(10000×g-30min)，在4℃下弃沉淀，取上清经肝素-琼脂糖亲和层析(流速2.8ml/min)提取、纯化HAC70，冻干备用。
1.4.3 实验分组
1.4.3.1 艾氏腹水瘤动物模型：取BALB/c小鼠10只(16～18g，雌雄不拘)，每只小鼠腋下接种艾氏腹水瘤细胞0.2ml(细胞浓度1.0×109/ml)，随机分为两组(每组5只)，其中：①免疫组：用纯化得到的HAC70进行背部皮下免疫(50μg/次，共2次，间隔7d)。②对照组：用同等剂量的生理盐水代替HAC70注射。
1.4.3.2 3H-TdR掺入释放法实验分组：取BALB/c小鼠12只，随机分成三组(每组4只)，其中：①免疫组：纯化的HAC70免疫实验小鼠(方法同前)。②荷瘤组：每只小鼠经腹腔接种艾氏腹水瘤细胞(细胞浓度1.0×109/ml)1.2ml。③对照组：用同等剂量的生理盐水代替HAC70注射。
1.4.3.3 观察指标：观察并记录两组小鼠皮下肿瘤结节重量、直径、生存时间和腹水出现时间。
1.4.4 3H-TdR掺入释放法检测杀伤活性。
1.4.4.1 制备效应细胞：取末次免疫注射后第5天的实验鼠各1只，拉颈处死，无菌条件下分别取出脾脏，制成单细胞悬液，以RPMI 1640完全培养基(含rIL-2 100IU/ml、15%NCS)调细胞浓度至1.0×107/ml作为效应细胞。
1.4.4.2 靶细胞标记：从新鲜腹水中收集艾氏腹水瘤细胞作为靶细胞(细胞浓度2.0×106/ml)，加入370Kq 3H-TdR(约10μCi)，于37℃水浴中孵育3h(每30min震荡1次)，彻底洗涤后用RPMI 1640调细胞浓度至2.0×105/ml。
1.4.4.3 细胞培养和活性测定：将100μl效应细胞、50μl已标记的靶细胞加入96孔培养板中(每组3～4个复孔)，使效靶比分别为200∶1、100∶1、50∶1和25∶1。20×g-30s离心，每孔加入混合酶液(1.2%胰蛋白酶、100μgDNA酶)50μl，于37℃水浴中消化30min，收集细胞于玻璃纤维滤膜，洗涤、干燥后放于闪烁杯中(含5ml闪烁液)在液闪计数器上测定脉冲数/min(CPM)，并计算出特异释放率。计算公式：
释放率(%)=(1-实验组CPM/对照组CPM)×100%
1.5 实验数据处理：以均数±标准差(x±s)表示，成对数据采用方差分
文档评论（0）