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PTEN反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞4EBP1eIF4E表达影响 　　[摘要]目的：探讨PTEN反义寡核苷酸（ASODN）抑制PTEN后对EC9706细胞4EBP1、eIF4E表达的影响。方法：利用阳离子脂质体介导PTEN的ASODN、无义寡核苷酸（N-ODN）转染EC9706细胞，终浓度为3μmol?L、6μmol?L、12μmol?L的ASODN为实验组，终浓度12μmol?L的N-ODN为无关对照组，不进行转染的为细胞对照组。运用免疫细胞化学检测浓度为3μmol?L、6μmol?L、12μmol?L作用24h、48h、72h后EC9706细胞4EBP1、eIF4E的表达。结果：PTEN的ASODN转染EC9706细胞后随浓度和时间增加4EBP1表达降低而eIF4E表达增强，在同一时间不同浓度和同一浓度不同时间差异均有统计学意义（P 　　[关键词]PTEN；反义寡核苷酸；EC9706细胞；4EBP；eIF4E 　　 　　PI3k/Akt/mTOR信号通路在肿瘤整个发生发展的演进过程中与多个至关重要的细胞生物学环节有关。PTEN、4EBP1、eIF4E为PI3K/Akt/mTOR信号转导通路中的重要组成因子，PTEN发挥着“分子开关”的作用[1]，对下游因子有调节作用。4EBP1和eIF4E为PI3K/AKT/mTOR信号通路的下游因子。eIF4F具有调节蛋白质翻译的作用，这种调节作用受翻译抑制蛋白4EBP1的影响，当4EBP1与eIF4E结合时就会对依赖帽结构的翻译的起始产生抑制作用[2]。 　　有关PTEN与PI3K/AKT/mTOR信号通路关系的报道见于胆管癌、胃癌、鼻咽癌等肿瘤细胞中，但抑制PTEN后对食管癌EC9706细胞4EBP1、eIF4E表达的影响，至今少见报道。为探讨抑制PTEN后对食管癌EC9706细胞4EBP1、eIF4E表达的影响，本研究采用反义寡核苷酸技术利用阳离子脂质体介导转染PTEN反义寡核苷酸于食管癌EC9706细胞，采用免疫细胞化学技术检测4EBP1和eIF4E的表达情况。 　　1材料与方法 　　1.1材料人食管癌EC9706细胞株（由河南省肿瘤病理重点实验室惠赠.）；10%胎牛血清的RPMI1640培养液购自四季青公司；Lipofecter脂质体转染试剂购自碧云天生物技术研究所；全硫代修饰PTEN的ASODN（5’GTTCGTCCCTTTCCAGCTTTACA3’）、N-ODN（5‘gtctatactaccagacagcttgagt3’）由上海生工合成； 　　兔抗人4EBP1多克隆抗体、兔抗人eIF4E多克隆抗体购自SantaCruz公司；1.2实验方法 　　1.2.1细胞分组培养及转染：复苏后的EC9706细胞在含10%新生胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于5%的CO2，370C，饱和湿度的Modle2300CO2孵育箱中培养，细胞在培养瓶中贴壁生长良好，隔天换液并传代一次。待细胞长满培养瓶后消化、离心、计数后以细胞数5.6×104个／孔种于三个24孔板培养。每板分终浓度为3μmol?L、6μmol?L、12μmol?L的ASODN实验组，终浓度为12μmol?L的N-ODN对照组和细胞对照组（不进行转染），每组设三个复孔。培养24h后按照Lipofecter脂质体转染试剂使用说明，在脂质体介导下转染终浓度为3μmol?L、6μmol?L、12μmol?L的ASODN和终浓度为12μmol?L的N-ODN，分别培养24h、48h、72h。 　　1.2.2细胞滴爬片的制备：分别收集作用24h、48h、72h的24孔板中细胞，各组制成密度为3.0×105个?ml的细胞悬液，向每个经清洗、泡酸、消毒的载玻片上滴100μl的细胞悬液，放入湿盒，置于细胞培养箱中培养8～9h，待细胞贴壁后晾干、固定、40C保存。 　　1.2.3免疫细胞化学的主要步骤：将待检测的各组细胞滴爬片标本水化，4EBP1和eIF4E抗体以1：100稀释后按照PV-9000二步法免疫组化检测试剂使用说明和ZLI-9031?9032?9033浓缩型DAB试剂盒使用说明进行操作。 　　1.2.4对照组设计：以PBS代替一抗作阴性对照；用已知的4EBP1、eIF4E蛋白阳性表达的乳腺癌组织作阳性对照。 　　1.2.6结果判定：4EBP1和eIF4E免疫细胞化学阳性信号位于细胞浆，呈棕黄色。每张滴爬片标本高倍镜下观察10个视野，采用十三点评分法，即以0-4分来判定阳性细胞的百分比：0分没有阳性细胞；1分，阳性细胞百分比小于10%；2分，阳性细胞百分比大于10%但小于50%；3分，阳性细胞百分比大于50%但小于80%；4分，阳性细胞百分比大于80%.染色强度染色强度根据无、弱、中、强分别计为0-3