基因工程-第七章 酵母基因表达体系.ppt

第七章 酵母基因表达体系 酵母基因组特征 与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp,编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。这就克服了在其它真核生物中隐性基因控制的形状难以检测的缺陷。 如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度： 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用; 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失; 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞; 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长，但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因表达受体。 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。此外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源蛋白稳定表达宿主系统的选择方案， 酵母菌的载体系统分为三种： 质粒载体 整合载体（integrating vector） 人工染色体 酵母质粒载体又分为： 酵母附加型质粒(yeast episomal plasmid,YEp) 酵母复制型质粒(yeast replicating plasmid,YRp) 酵母着丝粒质粒(yeast centromere plasmid,YEp) 酵母附加型质粒来源于野生型的酵母质粒，这种质粒存在于很多啤酒酵母株系中，功能不祥。但有一个重要特点是，该质粒被一段长度约为599bp的反向重复序列分为两个部分，每一个部分都含有一个启动子和该启动子控制下的两个基因。其中一个基因为FLP，它编码一个位点特异性的重组酶，这个酶可以催化反向重复序列之间的遗传重组。 酵母附加型质粒就是在这种质粒的基础上，加入酵母核DNA序列，以及大肠杆菌pMB9的部分序列组成。故其既可以在酵母中复制，又可以在大肠杆菌中复制。 酵母菌中天然存在的自主复制型质粒并不多，而且相当一部分野生型质粒是隐蔽型的，因此目前用于外源基因克隆和表达的载体质粒都是由野生型质粒和宿主染色体DNA上的自主复制子结构(ARS)、中心粒序列(CEN)、端粒序列(TEL)以及用于转化子筛选鉴定的功能基因构建而成。 2u质粒 几乎所有的酿酒酵母菌株中都存在一个6318bp大小的野生型2u双链环状质粒，它在宿主细胞核内的拷贝数可维持在50-100之间，呈核小体结构，其复制的控制模式与染色体DNA完全相同。2u质粒上含有两个相互分开的599bp长反向重复序列(IRs)，两者在某种条件下可发生同源重组，形成两种不同的形态(A和B)。该质粒上共有4个基因：FLP、REP1、REP2和D．其中FLP基因的编码产物催化两个IRS序列之间的同源重组，使质粒在A与B两种形态中转化，REP1、REP2和D基因均为控制质粒稳定性的反式作用因子编码基因．上述基因共转录出7种不同分子量的mRNA分子。 2u质粒还含3个顺式作用元件．其中单一的自主复制子结构(ARS)位于一个IRs的边界上，REP3(STB)区域是REP1和REP2蛋白因子的结合位点．对质粒在细胞有丝分裂时的均匀分配起着重要作用，FRT存在于两个IRs序列中，大小为50bP，是FLP蛋白的识别位点。 在寄主细胞内极其稳定性主要由两个因素决定： 第一，2u质粒在细胞分裂时可将其复制拷贝均分给母细胞和子细胞. 第二，当细胞中质粒拷贝数因某些原因减少时，2u质粒可通过自我扩增自动调节其拷贝数水平。 上述两种复制特性均与FLP蛋白的作用密切相关，这是2u质粒以有限的复制次数获得高拷贝的主要机制。 酵母复制型质粒来源于大肠杆菌质粒pBR322。同时加入了一段酵母染色体的自主复制序列。这种质粒一般不会与酵母染色体发生重组，它转化酵母的转化率很高，但是不能稳定遗传。 酵母着丝粒质粒：来源于酵母染色体的着丝粒周围的leu2和cdc10之间的一段1.6kb的序列。带有此着丝粒序列的质粒在酵母中的行为类似一微型染色体，它可以稳定遗传，并均匀地分配到子代细胞中，同时在宿主细胞中的拷贝数很低。 但