基因工程 第三章 载体（143P）.ppt

第三章 基因工程载体 内切酶的发现解决了异源DNA体外重组的技术问题，但是重组之后的异源DNA还必须回到细胞内（生物体中）才能显示出其生物活性。这就要求有一种运送载体（简称载体）来充当这样的角色。研究工作发现，在微生物中有1种非染色体（或称染色体外）的环状DNA（称为质粒）以及一些噬菌体（寄生在细菌中的病毒）、动植物病毒等可以作为这样的载体。 载体：vector,在基因工程中用于携带外源基因进入受体细菌或真核细胞的“运载工具”。载体的化学本质是DNA，目前基因工程中使用的载体大多是经过改造的质粒DNA或噬菌体DNA。将外源基因运送到原核细胞的载体的研究已相当深入，现已有多种具有优良特性的商品化载体可用于基因克隆。 质粒载体 λ噬菌体载体 粘质粒载体 M13噬菌体载体 真核细胞用载体 人工染色体 真核细胞表达载体 原核细胞表达载体 表达载体 在革兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种形式，即严紧型复制(stringent)和松弛型复制(Relaxed)。 严紧型质粒(如pSC101和p15A等)的复制由宿主细胞内DNA聚合酶III介导，并为质粒上编码的蛋白因子正调控，这些蛋白因子极不稳定，在宿主细菌的正常生长过程中，每个细胞通常只能复制少数几个质粒拷贝(1－3个) 松弛型质粒(如pMBl和ColE1等)的复制需要半衰期较长的DNA聚合酶I、RNA聚合酶以及其他复制辅助蛋白因子参与，当宿主细胞内蛋白质合成减弱或完全中断时，质粒复制仍能持续进行，因此这类质粒在每个宿主细胞中通常具有较高的拷贝数(30-50)； 当宿主细胞进入生长后期，加入氯霉素抑制蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，则松弛型质粒利用丰富的原料及能量大量复制，最终每个细胞可以积累上千个DNA分子，这种操作称为质粒的氯霉素扩增 质粒的接合转移能力与其复制型及分子大小间有一定的相关性： 分子量大，属于接合型质粒，拷贝数少，严紧型复制； 分子量小，属于非接合型质粒，拷贝数多，松弛型复制； 质粒改造与构建 (1)删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的相对分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大子20kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定； (2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数； (3)加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞； (4)在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头(polylinker)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入； (5)根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 质粒改造与构建 将pBR322进一步改造，可以形成根据优越性的衍生质粒 pBR322质粒载体的优点 λDNA至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。值得注意的是，在λDNA分子中从J基因到N基因之间，大约占λDNA总长度三分之一的区段对于λ噬菌体的裂解周期而言是非必需的。这一区段的缺失或在此段插入外源DNA片段，将不影响入噬菌体的增殖。这就是λ噬菌体可作为基因工程载体的一个重要的依据。 左侧区：基因A～J，参与噬菌体头部和尾部蛋白合成的基因 中间区：界于J和N之间，非必要区参与重组有关的基因 右侧区：N基因的右侧主要的调控成分 噬菌体或病毒DNA λ噬菌体特异性感染大肠杆菌的机制：是识别并吸附在宿主菌外膜的受体上，这些受体由细菌lamB基因编码，其正常功能是转运麦芽糖进入大肠细胞内。由于麦芽糖可诱导lamB基因的表达，而葡萄糖抑制受体的生物合成，因此用作λ噬菌体宿主的大肠杆菌应该在含有麦芽糖的培养基中培养。噬菌体在细菌上的吸附过程只需几分钟，之后，线型 λDNA分子通过尾部通道注入大肠杆菌细胞内，两端的cos区碱基配对形成环状结构，宿主菌的DNA连接酶迅速修复两个交叉缺口处的磷酸二酯键，封闭环状λDNA分子。此时，若λDNA不能有效地建立溶原状态，则从其复制起始位点(ori)以θ环方式进行环向复制，随后开始滚环式复制，这种复制形式的产物为λDNA分子的串联多聚体。 (1)charon系列，该系列的噬菌体DNA是为克隆外源DNA大片段而设计的取代型载体，其中charon40载体的非必需区域由多个头尾相聚的DNA小片段串联而成，每个小片段均含有一个相同的酶切口。在使用时，将载体DNA用这种限制性核酸内切酶处理，小片段DNA即可用聚乙二醇分级沉淀去除，剩下的长臂和短臂载体片段直