重组腺病毒载体介导人DeltaNpα转染对树突状细胞凋亡的抑制作用.docxVIP

重组腺病毒载体介导人DeltaNp73α转染对树突状细胞凋亡的抑制作用 作者：胡义杰 范士志 蒋耀光 李志平 陈建明 何勇 【摘要】 　　目的： 研究人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染人脐血来源树突状细胞对其成熟状态及其凋亡水平的影响. 方法： 用Adeasy系统构建人DeltaNp73α基因重组腺病毒；并通过增强离心法将其转染至人脐血来源DC；流式细胞仪分析转染后DC的成熟状态以及DC的凋亡水平. 结果： 成功构建了人DeltaNp73α基因重组腺病毒并高效转染DC；人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染提高了DCCD83，HLADR的表达，并能显著抑制其凋亡水平. 结论： 人DeltaNp73α基因重组腺病毒转染DC，促进DC的成熟并抑制其凋亡，将有效地提高DC疫苗的抗原呈递能力. 【关键词】 DeltaNp73α 重组 遗传 腺病毒科 树突细胞 树突细胞疫苗 0引言 免疫治疗是肿瘤目前极有前景的治疗手段之一. 激活特异性细胞毒性T淋巴细胞是实现肿瘤主动免疫治疗的关键. 树突状细胞能摄取特异性相关抗原、高水平的表达与抗原递呈有关的MHCI，MHCⅡ分子、多种共刺激分子及黏附分子，从而激活初始T淋巴细胞. 肿瘤细胞通过分泌一些免疫抑制因子来抑制DC的成熟及其功能，甚至通过相关信号通路诱导DC细胞的凋亡［1］. 具有抑制细胞作用的DeltaNp73α属于p53基因家族，其在肺癌组织中表达量和阳性表达率明显升高，是肺癌免疫治疗中较好的靶点. 我们拟通过构建DeltaNp73α的重组腺病毒并转染人DC，使DeltaNp73α在DC内稳定高表达、呈递，并探讨DeltaNp73α高表达对DC活化状态及凋亡水平的影响. 1材料和方法 材料真核表达质粒pcDNA3DeltaNp73αHA由意大利罗马大学Gerry Melino教授和Vincenzo De laurenzi博士惠赠，含DeltaNp73α基因cDNA全长约1700 bp. PAdTrackCMV，293T细胞，E. coli BJ5183，DH5α大肠杆菌由第三军医大学西南医院烧伤研究所提供. KpnI， XbaI， PmeI， PacI限制性内切酶以及T4DNA连接酶；脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒；大小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、RNA PCR Kit；人淋巴细胞分离液；人白细胞介素IL4，人粒单核集落刺激因子GMCSF，肿瘤坏死因子TNFα；AntiHA Tag Mouse monoclonal Antibody；Tripure Reagent；MCCelLytics Mammalian Cell Protein Extraction Reagent，BCA蛋白质定量测定试剂盒；goat antimouse IgG/HRP二抗；PEantiCD1a,PEantiCD83,PEantiHLADR及其同型对照；PEAnnexin V凋亡试剂盒. 根据GenBank中DeltaNp73α cDNA的序列，应用Primer 5软件设计针对其的特异引物并由Invitrogen公司合成. 方法 复制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73α的构建复制缺陷性腺病毒AdDeltaNp73α含全长人DeltaNp73α cDNA，由我科通过AdEasy系统构建. 50%组织培养转染剂量法测得病毒的滴度为×1011pfu/L. 人脐带血来源DC的分离培养经产妇同意后，取剖腹产时新生儿脐带血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心法［2］分离出单个核细胞，37℃, 50 mL/L CO2孵箱孵育. 2 h后转移未贴壁细胞至另一离心管供分离T细胞，贴壁细胞更换含有细胞因子IL4，GMCSF的培养基继续培养. 间隔1 d半量更换培养基，补充细胞因子IL4, GMCSF. 第6日收获未成熟DC；或者第5日换液时加入TNFα，刺激48 h后即第7日收获成熟DC. 重组腺病毒增强离心法转染DC参照文献［3］，采用离心法增强腺病毒转染DC. 转染后DC中DeltaNp73α的表达收集DC,腺病毒转染48 h的DC/AdDeltaNp73α以及对照组的DC/Adctrl. RTPCR分析DeltaNp73α mRNA水平； Western Blot分析DeltaNp73α蛋白表达水平. 转染前后DC表面标志物的变化收集DC，PBS洗涤细胞后，分别加入待检测的CD1a，CD83及HLADR抗体及其同型对照；4℃避光孵育30 min后，PBS液洗涤2次后上机检测. 凋亡水平的变化转染7 d收集DeltaNp73α腺病毒感染的DC；将细胞悬浮在1×结合缓冲液中，调整密度为×108/L；将细