N--羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法..docVIP

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法 摘要：本发明提供了一种N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒的制备方法。目前，疫苗黏膜免疫递送系统的研究日益得到广泛关注，然而，疫苗具有在体内降解和消除快、生物利用度低，体内半衰期短、需要佐剂和反复注射接种，副作用大、程序繁琐等缺点。另外，目前，大部分动物病毒病（如鸡新城疫、禽流感等）的灭活疫苗虽然能诱导产生高水平的血清循环抗体IgG，但不能诱导黏膜免疫应答，也就不能阻止病毒的感染。 利用可生物降解高分子材料纳米粒对疫苗进行包裹，不仅可以保护疫苗完成投递过程，避免体内酸碱环境和酶类对抗原的破坏，而且能使抗原的释放方式、速度、部位等具有一定的选择性和可控性，利于实现疫苗的控制释放和靶向传输，为疫苗剂型和免疫途径的多样化提供了广阔的前景。同时，纳米粒还具有佐剂作用，能增强疫苗的抗原性，并优化免疫应答的类型，从而提高接种效率、增强免疫效果。但是，作为黏膜免疫的递送载体，需具备永久正电性和生理环境下的水溶性，因为这样可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运，提高纳米粒的摄取率。 本发明以改性的壳聚糖N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（N-2-hydroxypropyltrimcthyl ammonium chloride chitosan，N-2-HACC）、N,O-羧甲基壳聚糖（N,O-carboxymethyl chitosan，N,O-CMC）为原料，以新城疫病毒（NDV）为模型药物，采用聚电解质复合法制备载新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒（NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。本发明制备的NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs具有良好的相容性和生物黏附性，克服了传统注射疫苗造成的顺应性差、注射器和针头导致感染、减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且制备方法简单易行，条件温和，生产成本较低、易于规模化生产。 权利要求书 一种N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N,O-羧甲基壳聚糖的合成及N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒，其特征在于包括以下步骤： 1、N-2-HACC合成 采用ETA与壳聚糖的氨基开环反应合成N-2-HACC。 2、N,O-CMC合成 采用氯乙酸法将壳聚糖碱化膨胀后与氯乙酸反应合成N,O-CMC。 3、NDV-N-2-HACC/N,O-CMC-NPs制备 采用聚电解质复合的方法制备N-2-HACC/N,O-CMC-NPs。 4、根据权利要求1所述的N-2-HACC的合成方法，其特征在于该方法的具体步骤为： （1）壳聚糖的脱乙酰化处理 将脱乙酰度为85%壳聚糖分散在质量分数为30% NaOH异丁醇溶液中，100℃条件下回流搅拌反应1h，倾去上清液，去离子水洗至中性；之后，再将壳聚糖分散在质量分数为30%NaOH异丙醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5h，倾去上清液，去离子水洗至中性。 （2）壳聚糖的浸泡处理 将脱乙酰处理的壳聚糖溶于体积分数为1%乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物；之后，在500-1000r/min搅拌条件下逐滴加入0.1mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH=9，逐渐有白色沉淀析出，浸泡8h，抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分；最后，向滤饼中加入15mL异丙醇，搅拌30min、分散均匀，倒入三口烧瓶。 （3）壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（ETA）开环反应 在N2保护条件下，将三口烧瓶升温至80℃，逐滴加入ETA的异丙醇溶液（9g/50mL），30min内滴完；反应12h后将三口烧瓶冷却至室温，加入150mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h，抽滤，冷冻干燥24h。 （4）N-2-HACC精制 将干燥后的N-2-HACC溶于去离子水中；之后，采用3G砂芯漏斗过滤，将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀；真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h；分装，充入N2密封室温保存。 5、根据权利要求2所述的N,O-CMC的合成方法，其特征在于该方法的具体步骤为： 溶胀　 准确称取5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇，搅拌，浸泡2h。 碱化 向反应器中加入质量分数为30%NaOH溶液60mL，搅拌均匀后浸泡2h，得碱化壳聚糖。 羧甲基化 　 准确称取20g氯乙酸，在搅拌状态下分数次加入到碱化壳聚糖中，60℃、反应8h，制得粗产品。 精制 把粗产品用一定量的乙醇洗涤几次，除去醋酸钠、氯化钠等盐类，抽滤后于60℃下干燥24h，得精制品。