天津大学，生物化学，课件，ppt 第四章-第四节-修改.ppt

第四节 氨基酸及蛋白质分离提纯1 第四节 氨基酸及蛋白质分离提纯2 一、氨基酸的分析分离1 一、氨基酸的分析分离2 一、氨基酸的分析分离2 一、氨基酸的分析分离3 一、氨基酸的分析分离4 1．分配柱层析1 1．分配柱层析2 1．分配柱层析3 1．分配柱层析4 2．滤纸层析1 2．滤纸层析2 2．滤纸层析3 3．薄层分析 4．离子交换层析1 4．离子交换层析2 4．离子交换层析3 5．气相色谱 6．高效液相色谱（HPLC） 二、蛋白质混合物的分离方法 1．根据分子大小不同的分离方法 （1）透析和超滤1 （1）透析和超滤2 （1）透析和超滤3 （2）密度梯度（区带）离心1 （2）密度梯度（区带）离心2 （3）凝胶过滤（分子筛层析）1 （3）凝胶过滤（分子筛层析）2 （3）凝胶过滤（分子筛层析）3 2．据蛋白质溶解度不同的分离方法 （1）蛋白质的盐溶与盐析1(盐溶1) （1）蛋白质的盐溶与盐析1(盐溶2) （1）蛋白质的盐溶与盐析2(盐析1) （1）蛋白质的盐溶与盐析2(盐析2) （2）等电点沉淀法 （2）等电点沉淀法 （3）低温有机溶剂沉淀法 3．根据蛋白质带电性的分离方法 （1）电泳法1 （1）电泳法2 （1）电泳法3（平板电泳） （2）离子交换层析法 （2）离子交换层析法 4．根据配体特异性的分离方法1 4．根据配体特异性的分离方法3 4．根据配体特异性的分离方法2 三、蛋白质的鉴定 （一）定性测定1(总） （一）定性测定2(1溶解度法) （一）定性测定2(2电泳法) （一）定性测定2(2电泳法) （一）定性测定2(3免疫学方法) （一）定性测定2(3免疫学方法) （一）定性测定2 (4超离心法) （一）定性测定2(5分光度度法) （一）定性测定2(6化学分析法) （二）定量检测1 (总） （二）定量检测2 (1凯氏定氮法1） （二）定量检测2 (1凯氏定氮法2） （二）定量检测2 (2双缩脲法） （二）定量检测2 (3福林一酚试剂法） （二）定量检测2 (4紫外吸收法） （1）蛋白质的盐溶与盐析 （2）等电点沉淀法 （3）低温有机溶剂沉淀法 蛋白质溶解度的主要影响因素： 1，溶液的pH；2，离子强度；3，介电常数；4，温度 盐溶：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。 机理：主要是蛋白质吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而且蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。在透析过程中，球蛋白分子沉淀析出，是因为除去了盐离子，使蛋白质之间相互吸引，引起蛋白质聚集。 等电点时，疏水基团相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种疏水作用力，使分子分散，溶于水中 盐析：一般盐浓度增大时，蛋白质的溶解度趋于减低，当盐浓度足够大时，蛋白质可从溶液中完全沉淀出来，称为盐析。以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质。另外常用的盐还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。 蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，它们被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合、沉淀。 蛋白质在等电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小 溶解度mgN/ml pH 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 1 2 3 0 5mM 1mM 10mM 20mM pH和盐浓度对β－乳球蛋白溶解度的曲线 曲线上的数值为NaCl的浓度 加入与水可混溶的中性有机溶剂，特别是甲醇、乙醇、丙酮可降低多数蛋白质的溶解度并使之沉淀。 （1）电泳法 （2）离子交换层析法 原理：由于各种蛋白质在同一pH条件下因分子量及荷电量不同使其电泳迁移率就不同。 常用的是区带电泳：所用支持物有滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂、淀粉、聚丙烯酰胺凝胶等。 目前还有SDS聚丙烯酰胺平板电泳、盘状电泳。这种电泳有三个物理效应：①样品的浓缩效应；②胶对分子的筛选效应；③一般电泳分离的电荷效应。因此使样品分离效果好，分辨率高。 新近发展的等电聚集区带电泳。是利用一种两性电解质作为载体放入电解槽中，通以直流电，两性电解质即形成一个由正极到负极的逐渐增加的pH梯度。当把蛋白质样品加入此系统时，带正电的蛋白质向负极移动，带负电的向正极移动，直至达到其等电点的pH的位置。此时蛋白质颗粒的净电荷为零,也就不再向任何一极移动，即聚集于其等电点的pH的位置。 阴离子交换剂或阳离子交换剂也可用于蛋白质分离。 阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出H+，当溶液中含有其他阳离子时（如在酸性环境中的蛋白质阳离子），它们可以和H+发生交换而“结合”在树脂 ；相反，阴离子交换树脂，可解离出OH－，能和溶液里的阴离子（如碱性环境中的带负电的蛋白质）发生交换而结合在树脂上。 常用的阳