基于微小凹图式的c17.2细胞三维聚集体形成及其电生物物理特性研究-study on the formation of 3d aggregates of c 17.2 cells and their electro-biophysical properties based on microconcave pattern.docxVIP

摘要细胞的体外培养是生命科学研究的基础，而将细胞体外培养时的生长状态调整到与体内细胞类似的生长状态是广大科研工作者一致在努力追求的目标。体外三维培养是最理想的解决办法。然而目前大部分的三维培养方法或多或少存在细胞生长均一性较差、结构构型不均匀、不利于进行光学检测等问题。以微小凹结构为代表的三维聚集体培养方法是近些年较多研究的新方法，能一定程度上克服上述问题。但目前此类方法还不能同时实现使细胞即能充分的进行养分交换又能与基底有一定的粘附，从而较为准确的还原体内细胞的生长状态。本研究将先解决这一问题，构建一个基于细胞凹面剥离行为的C17.2神经干细胞三维聚集体培养基底。我们基于紫外光光刻技术和软光刻技术制备了9种微小凹图式结构其中6种结构为五连孔微小凹，使用材料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolicacid，PLGA)和聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)。与C17.2神经干细胞的初步复合培养结果显示，基底在经过等离子氧蚀刻和多聚赖氨酸裱衬后，细胞接种后能快速进入微小凹，并能很好的在其上贴壁生长，而不同材质的基底对细胞生长和分布的影响几乎没有差异。C17.2细胞在微小凹中以扩增条件培养2天后仍维持均一的干细胞特性，这初步说明基底拓扑形貌的变化不会使C17.2细胞发生分化。利用延迟拍摄技术对同一微小凹内细胞行为的观察发现C17.2细胞接种后一开始逐渐贴壁，并相互连接成细胞串，随着培养时间增加，细胞串将从微小凹侧壁上剥落，并形成三维悬浮生长的细胞聚集体。利用扫描电镜也观察到类似的结果。CFSE荧光染色结果显示大部分三维生长细胞位于微小凹中靠近小凹口的区域悬浮生长。通过Logistic回归分析，发现较小的孔径和较窄的通道宽度有利于细胞聚集体的形成。结合细胞增殖统计结果发现，D80-W20和D100-W20结构的细胞倍增时间最短，同时这两种结构中细胞聚集体的形成率也最高。对F-actin和vinculin进行免疫荧光染色发现，细胞未形成成熟的粘着斑，但骨架排布有一定的差异。通过有限元方法对细胞串在微小凹侧面上剥离行为的模拟，发现微小凹模型中的初始剥离发生时的预应力(Criticalpeelingprestress，CPP)远小于平面模型中的CPP值，说明细胞在微小凹侧壁上比在平面培养时更容易剥离下来。而6种不同微小凹之间的CPP差异并不明显。通过对细胞瞬时弹性模量(Cellinstantaneouselasticmodulus，EC)和粘附层弹性模量(Adhesioninterfaceelasticmodulus，EA)这两I个参数进行全面考察，发现反应细胞剥离能力的PM/F(微小凹模型的CPP与平面模型的CPP的比值)与kC/A(EC与EA的比值)有较好的正相关性。上述研究表明，结合细胞的凹面剥离行为，我们成功的构建了一种可用于C17.2神经干细胞三维化悬浮生长的培养基底。本研究的另一方面将聚焦于评价不同生长状态C17.2细胞的电生物物理特性上。静息膜电位(Restingmembranepotential，RMP)是细胞的一个重要的电生物物理指标，它对许多功能性的膜蛋白具有调节作用，从而实现电刺激信号到细胞内化学信号的转换，并进而影响细胞的增殖、分化、凋亡等。然而目前利用膜片钳技术要实现对聚集体内细胞的膜电位检测存在困难，因此本研究将使用电势荧光染料作为指示剂实现C17.2细胞膜电位的检测，同时将改进现有该技术检测精度不高的缺陷。由于细胞膜钠钾通透性比值(PNa/K)能一定程度反映出细胞膜上不同离子通道的发育程度，因此我们RMP检测方法的基础上对这个电生物物理指标进行检测。研究中我们首次将双结合位点的拟合方法用于对细胞核区四甲基罗丹明甲酯(Tetramethylrhodaminemethylester，TMRM)非特异性吸附量的标定，对梯度高钾去极化的C17.2细胞进行RMP检测发现用TMRM法检测到的膜电位值与用膜片钳检测到的值基本一致，这很好的证明了此方法的可靠性和准确性。同时在利用CoroNa进行了胞内钠离子浓度的检测的基础上，结合戈德曼(Goldman)方程对细胞膜钠钾通透性比值进行了计算。最后将建立的新方法与Loew建立的方法以及我们前期采用的方法进行了比较，结果显示新方法比以往方法精度更高。我们进而对不同生长状态的C17.2细胞的电生物物理特性进行了考察。先对不同生长天数的C17.2细胞的RMP和PNa/K进行了检测，在细胞接种前3天，细胞膜电位存在一个逐渐变负的过程。之后我们采用了五种分化方法对C17.2细胞进行分化，最终选择了分化结果较为稳定的利用多聚赖氨酸进行基底裱衬来诱导分化的方法。通过形态学和免疫荧光检测发现大部分细胞都已经开始分化，但还未完全分化成成