建立葡萄糖二酸及其1,4内酯检测新方法及其抗炎作用的代谢组学初步研究-to establish a new method for the determination of gluconic acid and its 1,4 - lactone and a preliminary metabonomic study on its anti-inflammatory effect.docxVIP

摘要本研究前期工作发现了中药六味地黄丸(LWPs)中含有葡萄糖二酸盐。大量的药理实验研究表明葡萄糖二酸盐具有包括抗癌等广泛的药理作用。因此，本论文应用高效液相紫外检测器（UV）、蒸发光检测器（ELSD）和质谱检测器（MS）建立了六味地黄丸中葡萄糖二酸(GA)及其1,4内酯（1,4-GL）的含量测定方法，并研究了葡萄糖二酸及其1,4内酯在体内外的相互转化。在此基础上利用基于核磁共振（1HNMR）技术的代谢组学方法初步研究了葡萄糖二酸及其1,4内酯体内抗炎的代谢机理。主要研究结果如下：1.六味地黄丸中葡萄糖二酸及其（或）1,4内酯含量测定新方法的建立。1）、建立了六味地黄丸中葡萄糖二酸及其1,4内酯的高效液相色谱亲水紫外（HPLC-HILIC-UV）检测方法。六味地黄丸经20%的甲醇溶液超声提取后，用色谱柱HILIC色谱柱，以乙腈-5mM磷酸二氢铵+0.1%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱；柱温35℃；流速0.8ml/min；检测波长205nm；进样10μl。结果表明GA浓度在25-400μg/ml内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：A=0.0848C+0.6958r=0.9993（n=5）。1,4-GL浓度在25-400μg/ml内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：A=0.1430C+0.5917r=0.9996（n=5）。研究结果表明该方法专属性强、准确、灵敏、重现性好、结果稳定。六味地黄丸水蜜丸中GA的含量为7.10±3.2mg/g、1,4-GL为3.96±1.6mg/g，浓缩丸中GA为15.60±4.8mg/g、1,4-GL为8.34±4.3mg/g。2）、建立了六味地黄丸中葡萄糖二酸高效液相色谱亲水蒸发光（HPLC-HILIC-ELSD）检测方法。六味地黄丸经20%的甲醇溶液超声提取后，用色谱柱HILIC色谱柱；以乙腈-20mM醋酸胺，0--5min（80：20），5--25min（80：20--75：25），25--30min（75：25--50：50），30--35min（50：50--80：20），35--45min（80：20）为流动相梯度洗脱；流速0.8ml/min；柱温35℃；进样10μl；漂移管温度60℃；气流1.2L/min。结果表明葡萄糖二酸浓度在50-400μg/ml内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：A=0.5882C-7.0275r=0.9991（n=6）。研究结果表明该方法专属性强、结果准确、灵敏、结果稳定。六味地黄丸水蜜丸中GA含量为8.18±2.4mg/g、浓缩丸中为19.52±3.8mg/g。3）、建立了六味地黄丸中葡萄糖二酸1,4内酯超高液相色谱质谱（UPLC-IIMS/MS）的检测方法。六味地黄丸经20%甲醇超声提取后，用WatersBEHC18色谱柱，柱温：40℃。流动相：10mM甲酸-乙腈（90：10）；流速0.4ml/min，用UPLC-MS/MS检测。结果表明1,4-GL浓度在0.83-830μg/ml内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为：A=12.771C+15.47r=0.9990（n=5）。研究结果表明该方法专属性强、结果准确、灵敏、结果稳定。六味地黄丸水蜜丸中1,4-GL含量为4.03±3.1mg/g、浓缩丸为8.69±2.9mg/g。以上实验结果表明所建立的葡萄糖二酸及其（或）1,4内酯检测方法准确可靠，可用于六味地黄丸中葡萄糖二酸及其（或）1,4内酯含量的定量分析。2、探讨了GA和1,4-GL在体内外相互转化的规律。分别在室温条件下采用了pH为1.0、3.0、7.0、10.0、12.0，1,4-GL向GA的转变；温度为37℃、100℃不同pH（1.0、3.0、7.0）条件下GA向1,4-GL的转变。结果表明在室温、碱性条件下(pH=12.0)，1,4-GL立刻完全转变为GA；在水溶液中室温条件下GA向1,4-GL转化平衡需要两周以上，但在酸性条件（pH=1.0）和100℃条件下，GA向1,4-GL的转化较快（小于30min）和具有较高的转化率（33.3%）；同时我们还发现在给大鼠灌胃GA后，GA在胃内并没有迅速转化为1,4-GL，只是少量转化为1,4-GL（小于5%）左右。提示要充分发挥葡萄糖二酸衍生物的药理作用，应在体外使GA转化为1,4-GL。3、葡萄糖二酸及其1,4内酯对大鼠炎症作用的代谢组学研究。应用1HNMR技术结合主成分分析方法(PCA)，研究角叉菜胶诱导大鼠炎症模型、正常组及给药组尿液、肾脏组织、肝脏组织、血液成分图谱的差异。结果显示正常组和炎症组具有不同的代谢表型，经正交偏最小方差判别分析（OPLS-DA）确定了引起代谢表型差异的相关特征代谢物。如血液中丙酮酸、3-羟基丁酸、乳酸、肌酐水平上升；尿液中乳酸、丙氨酸、醋酸、柠檬酸